肿瘤细胞中多胺的过表达有助于免疫抑制微环境的建立，促进肿瘤生长。在这里，巧妙地设计了多功能铜-皮皮醇/HA纳米粒(Cu-Pic/HANPs)，通过抑制多胺合成，消耗细胞内多胺，并损害多胺摄取，有效地引起细胞内总多胺的消耗，从而增强热分解和铜还原。从而激活强大的免疫应答，实现抗肿瘤治疗。细胞内整体多胺耗竭导致线粒体功能障碍，不仅导致线粒体内铜离子激增，从而引起毒性蛋白聚集，诱发铜中毒，还会引发线粒体内活性氧(ROS)的积累。进而上调zDHHC5和zDHHC9的表达，促进气皮蛋白D(GSDMD)和GSDMD-N棕榈酰化，最终诱导焦亡增强。然后，发生增强的焦亡和铜突起，有助于重塑免疫抑制的肿瘤微环境，从而激活抗肿瘤免疫应答，最终有效抑制肿瘤生长和转移。这种通过综合多胺耗竭增强焦亡和铜突的治疗策略，为癌症免疫治疗提供了一种新的模板。该研究以题为“Multifunctional Copper-Phenolic Nanopills Achieve Comprehensive Polyamines Depletion to Provoke Enhanced Pyroptosis and Cuproptosis for Cancer Immunotherapy”发表在Advanced Materials上。
焦亡作为癌症免疫治疗中一种独特的程序性细胞死亡模式，已经引起了研究人员的极大关注。多胺(包括腐胺、精胺、亚精胺)作为肿瘤细胞中丰富的自由基清除剂，广泛参与细胞内氧化还原平衡的调节。肿瘤细胞中多胺的过度表达具有许多有害作用，如调节基因表达、逃避免疫检测、促进恶性增殖等。而且，与正常细胞和免疫细胞相比，肿瘤细胞在肿瘤微环境(TME)的特定缺氧条件下表现出对多胺的增强摄取。因此，靶向多胺来降低细胞内水平是一种有效的抗肿瘤治疗方法。作为一种天然多酚，皮杉醇(pictanol,Pic)具有多种生物活性，包括抗紫外线的光保护作用、促进胶原合成和血管舒张特性。更重要的是，Pic对Arg2具有有效的抑制活性，特异性地针对线粒体中的Arg2来减弱细胞多胺的合成。金属多酚是一种由金属离子和天然多酚构成的金属有机材料。通过精心选择金属离子和酚类配体，可以定制它们的物理化学特性以及生物功能。目前，利用铜酚类材料的铜离子过载介导的热下垂和铜下垂已被开发用于肿瘤治疗。
在此，作者设计了基于铜、Pic和透明质酸(HA)的多功能铜Pic/HA纳米颗粒(Cu-Pic/HANPs)。HA是一个可靠的屏障，确保Cu-Pic/HANPs在体内具有良好的循环能力和肿瘤靶向能力。Cu-Pic/HANPs通过实现细胞内多胺的完全消耗，从而增强了热死和铜死，从而实现了有效的癌症免疫治疗。首先，Cu-Pic/HANPs具有多种酶样活性，包括超氧化物歧化酶(SOD)样，过氧化氢酶(CAT)样，过氧化物酶(POD)样，和谷胱甘肽氧化酶(GSHOx)样，可引起细胞内ROS的积累，消耗细胞内多胺，从而增加细胞内氧化应激水平。其次，可生物降解的Cu-Pic/HANPs可以释放铜离子破坏溶酶体，从而降低位于溶酶体膜表面的多胺转运体ATP13A2的活性，减弱细胞吸收多胺并将其转移到细胞质中的能力。最后，释放的Pic可以通过抑制Arg2活性阻断细胞内多胺合成的上游途径，导致线粒体ROS积累。因此，从增强消耗、减少摄取、抑制合成三个角度，全面实现细胞内多胺耗竭，导致细胞内氧化还原失衡和多细胞器功能障碍。一方面，线粒体功能障碍导致线粒体内铜离子积累，随后发生相互作用与硫酰化二氢硫酰胺s-乙酰转移酶(DLAT)，导致脂质蛋白聚集和铜沉。另一方面，细胞内多胺的完全耗尽触发炎症小体募集，随后裂解焦亡蛋白GSDMD，有效诱导焦亡。此外，Cu-Pic/HANPs诱导线粒体内ROS积累，导致zDHHC5和zDHHC9表达上调，从而促进GSDMD和GSDMD-n的棕榈酰化过程，最终增加焦亡。然后，这种增强的焦亡和铜腐可导致损伤相关分子模式(DAMPs)的泄漏，逆转肿瘤免疫抑制的微环境，激活体内的抗肿瘤免疫应答。此外，免疫细胞的募集可以进一步抑制肿瘤的转移
图 1.Cu-Pic/HANPs通过综合多胺耗竭诱导焦亡和铜亡增强，激活抗肿瘤免疫治疗的示意图。
图 2.Cu-Pic/HANPs的材料表征。a)Cu-Pic/HANPs的TEM图像。b)Cu-Pic/HANPs的XPS光谱和c)Cu2pXPS光谱。d)Cu-Pic/HANPs的元素映射和e)EDS谱。f)Pic、Cu-Pic、Cu-Pic/HA和HA的FT-IR光谱。g)Cu-Pic和Cu-Pic/HANPs的zeta电位。h)Cu-Pic/HANPs在水溶液、PBS溶液和10%FBS介质中7天的动态光散射。数据以mean±S.D.表示(n=3)。i)Cu-Pic/HANPs在不同pH6.5、pH5.5、GSH(10mM)和H2O2(50μM)溶液下降解4小时的TEM图像。通过未配对的学生双侧t检验评估统计显著性。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图 3. Cu-Pic/HANPs的酶模拟活性和多胺氧化特性。a)Cu-Pic/HANPs多酶活性示意图。b)不同浓度Cu-Pic/HANPs存在时NBT和核黄素的紫外-可见吸收光谱。c)不同浓度H2O2溶液下Cu-Pic/HANPs的产氧量。d)浓度依赖性和e)Cu-Pic/HANPs氧化TMB的时间依赖性。f)Cu-Pic/HANPs的pod样Michaelis-Menten动力学分析。g)Cu-Pic/HANPs的GSH消耗浓度依赖性和h)时间依赖性。i)Cu-Pic/HANPs的gshox样Michaelis-Menten动力学分析。j)Cu-Pic/HANPs氧化精胺和亚精胺的示意图。精胺和精胺的浓度依赖性氧化。数据以mean±S.D.表示(n=3)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图4.细胞内多胺耗竭的内吞作用和机制。a)罗丹明b标记的Cu-Pic/HANPs的4T1内吞荧光图像。b)4T1细胞中罗丹明b标记的Cu-Pic/HANPs(红色)和溶酶体(绿色)共定位分析。c)不同处理后ATP13A2、HIF-rr、Arg2水平的WB分析。d)Cu-Pic/HANPs诱导细胞内总多胺耗竭示意图。e)4T1细胞的ROS水平。f)流式细胞术检测ROS水平。g)DHE染色检测ROS。h)4T1细胞GSH消耗。数据以均数±sd值表示(n=5).i)4T1细胞中的铜离子水平。j)不同处理后的精氨酸免疫荧光图像。k)不同处理后4T1细胞多胺水平。数据以均数±sd值表示(n=3)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图 5.铜突发病机制。a)JC-1染色检测线粒体状态。b)不同处理后4T1细胞内ATP水平。c)不同处理后的DLAT免疫荧光图像和d)相应的强度分析。数据以均数±sd值表示(n=3).e)诱导铜体畸形示意图。f)不同处理后ATP7A、LIAS和FDX1水平的WB分析。采用未配对的学生双侧t检验评估统计学显著性。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图6.激活增强的焦亡。a)不同处理后4T1细胞的Bio-TEM图像。b)不同处理后的GSDMD-N和c)zDHHC9免疫荧光图像。d)不同处理后NLRP3、zDHHC5、zDHHC9、GSDMD-N和CleavedCaspase-1水平的WB分析。e)Cu-Pic/HANPs通过整体细胞内多胺耗竭诱导热亡增强示意图。f)LDH和g)IL-1细胞外分泌水平。数据以均数±sd值表示(n=3)。h)ATP细胞外分泌水平。数据以均数±sd值表示(n=5)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图7.细胞毒性，巨噬细胞极化和DCs成熟。a)不同处理后MCF-7和4T1细胞的存活率。数据以均数±sd值表示(n=5)。b)4T1细胞Calcein-AM/PI双染。c)不同处理后细胞凋亡水平。d)Transwell法评价巨噬细胞极化示意图。e)流式细胞术测定的RAW264.7细胞表型。f)m1型巨噬细胞的平均百分比。g)不同刺激后DCs的流式细胞术分析。h)成熟DCs的平均百分比。数据以均数±sd值表示(n=3)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图8.体内免疫激活。a)不同刺激后m1型巨噬细胞的流式细胞术分析。b)m1型巨噬细胞群体。c)不同刺激后DCs的流式细胞术分析。d)DCs群体。e)CD4+T细胞，f)CD8+T细胞，g)记忆T细胞和h)Tregs细胞群体的流式细胞术分析。i)肿瘤载玻片中的CD4+(绿色荧光)和CD8+(红色荧光)T细胞。j)激活体内免疫反应的过程。数据以mean±S.D.表示(n=3)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图9. 体内抗肿瘤治疗。a)BALB/c小鼠抗肿瘤实验过程。b、c)不同处理后第1天至第15天肿瘤生长曲线。d)不同处理后的肿瘤图像。e)不同处理后H&E和TUNEL染色的肿瘤切片。f)H&E染色肺切片和肺组织照片。g)不同治疗后的肿瘤重量。数据以均数±sd值表示(n=5).肿瘤组织中h)精胺、i)亚精胺、j)多胺含量。数据以均数±sd值表示(n=3)。统计显著性通过未配对的学生双侧t检验来评估。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
综上所述，作者成功地设计和合成了Cu-Pic/HANPs，通过全方位的细胞内多胺消耗来促进焦亡和铜亡，从而有效地抗肿瘤治疗。Cu-Pic/HANPs具有多种酶活性，产生丰富的ROS，同时对Arg2活性也有抑制作用，从而抑制多胺合成途径。令人兴奋的是，Cu-Pic/HANPs可以通过抑制细胞内多胺合成，增加多胺消耗和减少多胺摄取来实现细胞内多胺的总消耗。一方面，多胺的总消耗可能导致线粒体功能障碍和ATP供应不足，导致毒性蛋白聚集，从而引发铜残症。另一方面，综合多胺耗散可激活Caspase-1/GSDMD通路，上调GSDMD的s-棕榈酰化，诱导焦亡增强。DAMPs的释放进一步增强了体内免疫应答，在抗肿瘤治疗中表现出显著的疗效。这种由细胞内整体多胺耗竭引起的焦亡和铜亡增强的治疗策略为癌症免疫治疗提供了新的切入点。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1002/adma.202409066
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