超级细菌的流行使得抗生素治疗越来越无效。更糟糕的是，对于由两种或多种多重耐药细菌引起的多微生物感染，几乎没有适用的药物治疗方案。本文设计并合成了一组抗菌环肽，其先导化合物cyclo-zp80r对广谱细菌具有良好的活性。令人鼓舞的是，它对两种重要的表皮物种铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的单感染和合并感染都有很强的杀菌作用。肽环-zp80r被认为可以破坏革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的膜结构，引起多种生理障碍。为了更好地适应这种新型抗菌剂的局部给药，优化了一种由泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和透明质酸组成的水凝胶配方。这种三元水凝胶体系能够在皮肤温度下形成原位凝胶。包封肽分子在人体皮肤离体模型和小鼠伤口在活体内的模型中稳定释放，治疗双微生物感染。本文系统地研究了一种新型环状肽的设计、合成、抗菌机制及其局部伤口感染的给药策略，为治疗多药耐药的多微生物伤口感染提供了一种有前景的治疗方法。该研究以题为“Ternary Thermosensitive Hydrogel-Encapsulated Macrolactam Heneicosapeptide Eliminates Epidermal Multidrug-Resistant Bi-Microbial Colonization”发表在Advanced Functional Materials上。
开放性伤口可能是细菌繁殖的温床，引起致病性感染、菌血症，严重者甚至死亡 在这个后抗生素时代，患者和医生迫切需要新的和更有效的抗菌药物，根据世界卫生组织的数据，目前只有13种新型抗生素正在进行III期临床试验。 如果没有有效的治疗策略，到2050年，全球每年由耐多药细菌感染造成的死亡人数可能达到1000万，在常见的表皮微生物中，铜绿假单胞菌（PA）和金黄色葡萄球菌（SA）备受关注，并被列为六种臭名昭著的ESKAPE细菌中的两种，革兰氏阴性PA和革兰氏阳性SA在同一微环境中共存，进一步加剧了合理治疗的难度 从广谱生物活性的角度来看，膜靶向抗菌肽（AMP）是一类很有前途的抗菌剂，这种类型的分子通常具有两亲性和阳离子性，使其与脂质细菌膜具有良好的亲和力，据报道，许多抗菌肽对正常细胞无细胞毒性，但能够杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体，课题组之前合成了一种具有广泛抗菌谱的𝛼𝛼𝛽𝛽-type(𝛼：疏水氨基酸；𝛽：亲水性氨基酸)（IIRR）4-NH2（zp80）线性肽。不幸的是，随后的实验表明，该肽在蛋白酶存在下稳定性弱，体外细胞毒性高，这可能严重阻碍其潜在的临床应用。
与线性肽相比，环状AMP具有更高的治疗潜力，因为它们通常具有更好的蛋白水解稳定性 因此在该研究中对zp80进行了两个方向的修饰。 首先将l -精氨酸替换为非天然阳离子氨基酸，如d -精氨酸(r)、鸟氨酸(O)或s -2,3二氨基丙酸（Dap）。其次在c端偶联了一个内酰胺环，以获得抗菌活性和对哺乳动物细胞毒性之间的最佳平衡。这些努力产生了四个头对侧链环状AMP。系统测定了它们的抗菌和溶血活性。然后，选择先导化合物进一步研究其可能的作用模式。 按需释放生物活性分子也是一个挑战。合理的给药系统设计，使抗菌效果最大化 鉴于游离药物溶液可能无法有效地保留在伤口部位以达到有效治疗伤口感染的目的，因此将设计的肽配制成由泊洛沙姆407(P407),泊洛沙姆188（P188）和透明质酸（HA）组成的三联热敏水凝胶。这种原位水凝胶伤口敷料允许在感染部位持续释放合并的肽，以延长治疗效果。在离体人体皮肤和小鼠伤口感染模型中验证了其抗菌效果。 总的来说，这项工作报道了一种新颖的环肽治疗与PA和SA相关的双微生物伤口感染的有效水凝胶递送系统。
图1.从头设计肽的化学结构。可变位置分别以蓝色(l -精氨酸)、红色(d -精氨酸)、粉红色(鸟氨酸)、紫色(2,3-二氨基丙酸)和绿色(内环酰胺)突出显示。
图2.A)设计的多肽和已批准的抗生素粘菌素、万古霉素和美罗培南对不同菌株的MIC值。PA，铜绿假单胞菌ATCC 15692;EC，大肠杆菌ATCC 25922;SL，鼠伤寒沙门氏菌PY1;KP，肺炎克雷伯菌ATCC 78578;AB，鲍曼不动杆菌ATCC 19606;SA，金黄色葡萄球菌ATCC 29213;MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 1717;LM，单核增生李斯特菌ATCC 19114;BS，枯草芽孢杆菌ATCC 23857;EFS，粪肠球菌ATCC 29212;YE，小肠结肠炎耶尔森菌;KO，克雷伯氏菌;CF, freundii柠檬酸杆菌;ECL，阴沟肠杆菌;EFM，屎肠球菌;B)设计肽和批准抗生素的平均MIC值;C)环-zp80r对HaCaT细胞的细胞毒性;D) zp80r和环-zp80r对大鼠红细胞的溶血作用。黑色箭头突出了高浓度肽的溶血情况，T表示0.1% Triton X-100;在环-zp80r和8μm的粘菌素/万古霉素存在下，PA E)和SA F)的时间杀伤曲线;G)环-zp80r对PA和SA的MBC。
图3.在胰蛋白酶存在下，设计肽的MIC折叠改变为PA A)和SA B);C)胰蛋白酶处理前后环-zp80r的HPLC分析;D) PBS或cyclop -zp80r处理后不同FBS浓度梯度下PA和SA的OD600值;E)环-zp80r在水和50 mm SDS溶液中的CD光谱;F)预测了环-zp80r的首选构象模型。
图5.A) PA和SA Zeta电位变化;B) PA的磁导率; PA C)和SA D)的CM渗透率; PA E)和SA F)的膜电位改变; PA的活性氧G)，SA的活性氧H)。I) cyclozp80r的抑菌机理示意图。
图6.A)环-zp80r存在下PA和SA混合物的细菌生长曲线;B)环-zp80r在不同pH值下的抗菌效果;C) PA和SA混合物在(a)和(b) cyclop -zp80r处理前的SEM图像。比例尺:4 μm;D)双微生物定植示意图;(E) PA和SA双微生物生物膜可视化。未处理2D (a)和3D (b)格式。Cyclo-zp80r以2D (c)和3D (d)格式处理。比例尺:20 μm;(e)和(f)环-zp80r处理前后的生物膜厚度评价。
图7.A)三元水凝胶示意图;B)水凝胶配方的响应面曲线;C) F11在4°C-25°C-37°C-25°C循环中不含/存在环-zp80r的热敏性测试;D)负载环-zp80r的水凝胶凝胶;E) p407、HA、BG和HEP的FTIR光谱;F) 500倍(a和d)、2000倍(b和e)和5000倍(c和F)倍率下BG和HEP的SEM图像;G) BG和HEP的储存模量(G′)和损耗模量(G″)与温度的关系;H) cyclozp80r的释放曲线;I)对PA和SA混合物的时效动力学。
图8.A)猪皮水凝胶机械压力试验。(a)创口制作，(b)凝胶注射，(c)拉伸，(d)扭转，(e)弯曲，(f)压缩。水凝胶用结晶紫染色，以便更好地观察;B)人体皮肤模型示意图;C)皮肤组织细菌计数;D)损伤皮肤组织的组织学检查。(a)未感染，(b) PBS治疗，(c) FP治疗，(d) HEP治疗。黑色箭头表示细菌细胞粘附在伤口表面。
图9.A)小鼠伤口感染模型示意图。B)伤口部位的图像。(a)无感染的干创面，(b) PBS处理，(c) HEP处理，(d) FA乳膏处理。C)伤口部位细菌计数。D)伤口愈合过程的典型图像。E)线圈大小随时间变化。
综上所述，这项研究设计并合成了一个很有前途的环肽，命名为肽环-zp80r。它显示出对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的广泛抗菌谱，特别是对许多临床分离株和耐药超级细菌。肽环-zp80r通过与带负电荷的细胞膜相互作用，引起电位耗散，从而抑制电子传递链和ros的异常积累，从而发挥抗菌活性。为了控制PA和SA的双微生物定植，环-zp80r在浮游和生物膜状态下都表现出良好的生物活性。为了有效地治疗双微生物细菌感染的开放性伤口，开发了一种三元热敏水凝胶配方。它由P407、P188和HA组成，质量分数分别为18%、1%和0.15%。进一步验证了该多孔水凝胶是缓释环-zp80r的合适系统。该水凝胶在皮肤表面凝胶化后，能承受适度的机械压力而不脱落或被破坏。包封的环-zp80r分子能够持续释放，消除表皮双微生物定植。本文从新型环状肽的设计、化学合成、局部创面感染抗菌机理研究、处方优化等方面进行了系统的研究。提出的治疗方法可能是治疗双微生物伤口感染的一种有前途的策略。
论文链接（DOI）：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202420652
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