上海大学陈雨教授团队《AM》：一种“外压电内表观遗传”逻辑门控泛凋亡用于骨肉瘤超声免疫治疗和骨再生

因此，基于上述考虑，本文研究团队开发了独特的介孔压电SrTiO3纳米粒子 (MeST NPs)，其中负载了DNA甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，用于靶向泛凋亡介导的声免疫治疗。首先通过简单的一步水热反应制备了具有可控孔径的MeST NPs。然后研究了纳米结构对压电声敏剂的ROS生成功效和效率的影响，表明压电材料比表面积的增加将有利于压电材料的作用位点对超声照射，从而促进声化学反应和ROS生成的效率。随后，为了进一步增强肿瘤内泛凋亡发生的特异性，避免对正常组织产生毒副作用，将载EGCG的MeST NPs（记为STE）与3D打印生物活性玻璃支架杂交，形成多功能复合支架（记为STE-BG），用于骨肉瘤PANoptosis免疫治疗。在该体系中，得益于MeST的高声动力效率，超声引发的ROS生成作为“外部”输入信号，诱导肿瘤细胞泛凋亡。同时，大量ROS的产生可以破坏细菌膜的选择性通透性，有效杀灭细菌，显著降低骨肉瘤支架植入后耐药菌的发生率。同时值得注意的是，特定的酸性肿瘤微环境(TME) 显著促进了EGCG 的稳定性和下游 DNA 甲基化的逆转，这已被研究作为增强癌细胞焦亡的“内部”输入信号。结合这些，可以特异性地激活“外部与内部”逻辑门来实现压电 泛凋亡。该过程通过彻底破坏细胞屏障和释放 DAMP 来触发免疫反应，从而促进树突状细胞 (DC) 成熟并增强抗肿瘤免疫反应。此外，BG 支架和Sr元素的众所周知的生物活性可以在将复合支架植入骨缺损后加速骨髓间充质干细胞 (BMSC) 的成骨分化，增强骨再生。总体而言，这项工作提供了一个逻辑门控声压电生物材料平台，同时外源性/内源性激活泛凋亡，用于通过抗菌和骨重建根除骨肉瘤。

图1. 逻辑门控声压电生物材料平台示意图。a) STE-BG支架的制备过程。b) “外部声压电和内部去甲基化调控”泛凋亡激活的具体机制。c) 下游免疫激活机制和d) 骨肉瘤的骨再生。

图2. 声压电支架的设计和制备。a) MeST NPs的TEM 图像。比例尺200 nm。b) MeST NPs的元素映射。比例尺200 nm。c) MeST NPs的晶格条纹图像。比例尺5nm。d) 氮吸附-解吸等温线和 e) MeST、MiST 和NpST的XRD图案。f) MeST NPs的PMF特性和振幅蝶形环显示相位和位移响应。g) MeST NPs的带隙和h) 价带。i,j) 检测压电效应产生的 i) ¹O₂ 和 j) ·OH的ESR曲线。k,l) ST NPs 在 US 照射下对 k) DPBF和 l) MB的时间依赖性消耗。m) ST NPs的声压电效应示意图。 n) STE涂层前后BG支架的照片，以及相应的SEM 图像和元素映射图像。比例尺从左到右分别为：2.5 mm、500 μm、20 μm、500 μm和500 μm。

图3. 鉴定DNA去甲基化作为骨肉瘤预后因素。a,b) 构建LASSO cox模型。c) 训练集的OS。 d) 测试集的OS。e) 模型训练集中的ROC曲线。f) 外部验证集的OS。g) 外部验证数据集的ROC。h) 训练集中高风险组与低风险组之间的生存差异。

图4. STE-BG支架在体外诱导泛凋亡。a) 维恩图显示对照组和STE-BG+US照射组之间的基因表达差异。b) 用PBS或STE-BG+US处理后，骨肉瘤细胞表达差异基因的火山图。c,d) STE-BG+US或对照（n=3）处理MNNG/HOS Cl细胞后，代表泛凋亡或去甲基化相关基因上调的热图。e) 诱导泛凋亡的示意图。f) 颜色编码组：A：BG，B：BG+US，C：STE-BG（BG支架用MeST@EGCG涂覆），D：ST-BG（BG支架用MeST涂覆）+US，E：STE-BG（BG支架用MeST@EGCG涂覆）+US。 g) CLSM 成像显示不同支架上的 MNNG/HOS Cl 细胞中 ROS 的产生。比例尺为 400 μm。h) FCM 测量用不同分组处理的 MNNG/HOS Cl 细胞的凋亡水平和定量数据。i) FCM 观察用不同分组处理的 MNNG/HOS Cl 细胞的线粒体膜电位变化。j) FCM 分析用不同分组处理的 MNNG/HOS Cl 细胞中的坏死性凋亡水平。 k) 用不同分组处理的MNNG/HOS Cl细胞中5-hmC的IF染色的CLSM图像。比例尺：400 μm。l) 不同分组中通过IF染色对cyto C表达的不同调节。比例尺为400 μm。m) cyto C、n) 切割的caspase-3和o) 经分组处理后，在MNNG/HOS Cl细胞中通过蛋白质印迹法表达不同的GSDME-N蛋白。p) 光学显微镜图像显示用STE加US处理的MNNG/HOS Cl细胞的焦亡特征（黑色箭头代表气泡突出）。q) 不同分组中 LDH 释放量。

图5. STE 复合支架诱导的 PANoptosis 的体外抗肿瘤效果和免疫反应。a) 树突状细胞活化示意图。b) 不同组别颜色划分图。c) MNNG/HOS Cl 细胞与 STE-BG 支架孵育后的细胞活力。d) 不同分组处理的MNNG/HOS Cl细胞的细胞活力。e) 不同分组处理后，支架上的 MNNG/HOS Cl细胞被Calcein-AM（绿色通道）和 PI（红色通道）染色的 CLSM 图像。比例尺为 400 μm。 f)不同分组中MNNG/HOS Cl 细胞胞内 ATP 浓度。g) 不同分组支架中 CRT（绿色通道）的 CLSM 图像。比例尺：400 μm。h) 不同分组经过不同处理后胞外 HMGB 1 分泌含量。i) transwell 检测方案图。来自 BioRender.com。j-l) 各分组经过不同处理后炎症因子 j) IFN-α、k) IL-6 和 l) TNF-α的分泌。 m) FCM 分析中成熟的 DCs（CD80+ CD86+ 在 CD11c+ 细胞中）的比例和 n) 各组（n = 3）中各自对应的定量分析。

图6. STE-BG支架的体内抗肿瘤评价。a)体内治疗方案示意图。b)不同组荷瘤小鼠的平均体重，n = 5）。c)肿瘤重量，d) RTV，和e) 用不同分组（n = 5）治疗的小鼠在14天治疗期后的肿瘤抑制率。f)不同分组中各种实验小鼠的肿瘤的H&E、TUNEL和PCNA染色图像。比例尺为50μm。g)治疗期间的各自肿瘤体积和不同治疗后的肿瘤照片（n = 5）。 h) FCM 分析各组成熟树突状细胞 (CD80+ CD86+ 在 CD11c+ 细胞中) 的比例 (n = 3)。i) 肿瘤中 CD8+ T 细胞在 CD3+ 细胞中的代表性 FCM 图及其定量分析 (n = 3)。j) 肿瘤中 CD45+ T 细胞的代表性 FCM 图及其定量分析 (n = 3)。

图7. STE-BG 支架在 US 照射下的抗菌和成骨潜力评估。a) 不同实验组处理后琼脂平板上 MRSA 菌落扩散的代表性图像。b) 不同分组用 NucGreen（绿色通道）和 EthD-III（红色通道）染色的 MRSA 荧光显微镜图像。比例尺：100 μm。c) 显示不同实验组小鼠伤口愈合进展的图表。d) 相应小鼠组伤口部位皮肤组织的 H&E、Masson 和 CD31 免疫组织化学染色图像。比例尺：分别为 600、80、1000、80 和 50 μm。e) 不同组培养 21d/14d 后的 BMSCs 茜素红和 f) ALP 染色。比例尺：5 mm。 g) 粘附于 STE-BG 支架的 BMSC 中细胞骨架的荧光染色。比例尺：50 μm。h) 与 BG 和 STE-BG 支架一起孵育后的 BMSC 细胞活力。i) 体外培养 7 天内不同组 (对照组、BG 组、STE-BG 组) BMSC 中成骨基因表达 (ALP、OSTERIX、OPG 和 RUNX-2) 的 qPCR 分析。j) 用对照组、BG 组、STE-BG 组处理的 UV-vis 中 ALP 的 OD 值。k) 颅内缺损模型简化图。缺损区域植入 STE-BG 支架 (右) 和对照组 (左) 以进行比较。l) 植入后 4 周和 12 周从 SD 大鼠获得的 Micro-CT 图像。比例尺为 2.5 毫米。 m,n) 不同组（对照组、STE-BG）在不同时间点（4 周和 12 周）的 m) BMC 和 n) BMD 表达。

联系小编可免费投稿推送，本公众号另建有纳米医学实名学术交流群，请备注姓名+单位+研究方向添加下方微信号。