中国科学院阎锡蕴院士团队《Nat Commun》：一种生物启发的硫-Fe-血红素纳米酶具有选择性过氧化物酶样活性用于增强肿瘤化疗

摘要

   铁基纳米酶因其生物相容性和过氧化物酶样活性而得到认可，有望成为肿瘤治疗的催化剂。然而，它们同时存在的过氧化氢酶样活性通过将肿瘤组织中的过氧化氢转化为氧气来破坏治疗效果，从而减少羟基自由基的产生。为了应对这一挑战，本研究引入了血红素-半胱氨酸-Fe（HCFe） 纳米酶，它表现出独特的过氧化物酶样活性。HCFe通过涉及Fmoc-l-半胱氨酸、血红素和Fe²⁺配位的超分子组装方法构建，在其活性中心内明显地掺入血红素和[Fe-S]。与血红素中心Fe原子的硫配位对于调节HCFe纳米酶对过氧化物酶样活性的催化偏好至关重要。这种独特的机制将HCFe与其他双功能铁基纳米酶区分开来，增强了其催化选择性，甚至超过了天然过氧化物酶。这种选择性活性使HCFe能够显着提高ROS的产生并发挥细胞毒作用，尤其是与顺铂联合使用时，对雌性小鼠中耐顺铂的食管鳞状细胞癌 （ESCC） 细胞及其异种移植物。这些发现强调了HCFe作为多模式癌症治疗关键组成部分的潜力，特别是在增强化疗疗效方面。该研究以题为“A bioinspired sulfur–Fe–heme nanozyme with selective peroxidase-like activity for enhanced tumor chemotherapy” 发表在Nature Communications上。    

  纳米酶作为纳米材料的一个特殊类别而出现，以其酶特性而闻名，与传统酶和化学催化剂的优点相辅相成。它们以其在温和条件下催化酶-底物反应的能力而闻名，这归因于其强大的催化活性、稳定性、成本效益、易于修饰和大规模生产的潜力。这些特性推动纳米酶成为天然酶在各种应用中的强大替代品，包括疾病诊断和治疗，分析化学， 生物传感，和环境修复。然而，与天然酶相比，纳米酶的选择性较低，经常受到批评，因为天然酶对底物和反应途径具有高度特异性。最近的研究旨在通过增强纳米酶的特异性来克服这一挑战。Li等人开发了一种类似于氧化酶的MOF-818纳米酶，它模仿天然儿茶酚氧化酶，实现了对儿茶酚氧化的高特异性。Wang等人通过调整配位数来调节钼单原子纳米酶（MoSA-Nx-C）的过氧化物酶样特异性。Xu等人在掺铁碳点纳米酶中引入了 “电子锁定 ”策略，通过操纵电子转移来控制催化选择性。这些研究进展展示了微调纳米酶选择性的可行方法，拓宽了它们在复杂系统中的潜在应用。

   铁基纳米酶具有良好的生物相容性和过氧化物酶样（POD）活性，在催化肿瘤微环境中的H₂O₂ 转化为羟自由基方面特别有效，开辟了肿瘤催化治疗的新领域。与天然POD固有的高催化选择性相反，这些纳米酶具有依赖pH值的双功能酶活性，同时具有POD和过氧化氢酶的功能。在过氧化氢作为底物的情况下，铁基纳米酶表现出多种催化途径。CAT活性可将肿瘤组织中可用的H₂O₂ 转化为氧气，从而减少羟基自由基的形成，因此特别有损疗效。鉴于这种复杂性，有必要制定完善的策略，以充分发挥铁基纳米酶的潜力。寻找具有单一POD活性的铁基纳米酶，是为了提高基于纳米酶的肿瘤催化疗法的有效性。消除竞争性CAT活性有可能释放这些纳米酶的全部治疗潜力。

   以前对天然POD和过氧化氢酶活性中心结构的分析表明，这两种酶都含有固有的合成基团hemin。作为天然氧化还原酶中的一个重要人工基团，hemin的特点是中心铁原子（Fe）与四个氮原子（Fe-N₄）配位，形成基本配位环境。这种环境对酶的氧化还原功能起着至关重要的作用。然而，本文注意到，天然POD和过氧化氢酶催化中心的氨基酸残基差异很大。这使假设，操纵hemin的配位环境有可能调节基于hemin的酶的催化选择性和特异性。此外，铁硫（Fe-S）结构在天然氧化还原酶中也起着至关重要的作用。这些由铁原子和硫原子组成的结构形成活性中心，参与底物的结合和转化。Fe-S结构是关键的无机辅助因子，可促进各种酶（包括脱氢酶、氢化酶和某些单氧酶）的催化活性。它们主要通过参与氧化还原反应和促进电子转移来催化一系列化学反应，如碳氢键的断裂和各种氧化反应。铁硫结构中的铁原子具有在不同氧化态之间切换的多功能性，这增强了它们作为电子传递媒介的有效性，并进一步促进了底物的氧化。Hemin和Fe-S结构在氧化还原反应中的关键作用提出了一种方法：将hemin和Fe-S结构结合起来，形成一个活性中心，从而有可能提高基于hemin的纳米酶的催化选择性和特异性，使其具有类似POD的活性。

研究概况

    在这项工作中，开发了一种具有催化选择性和类似POD专有活性的hemin-cysteine-Fe（HCFe）纳米酶。本文方法包括整合巯基，使其与海明中的铁原子配位，形成一个辅助催化中心。利用Fmoc-半胱氨酸、血红素和铁配位的超分子组装过程，合成了一种HCFe纳米酶。HCFe纳米酶在弱酸性条件下表现出类似POD的独特活性，这归因于硫与血红素中的铁原子配位时产生的电子负载影响。由于不存在类似催化酶的活性，HCFe在ROS介导的肿瘤治疗中具有更大的潜力。进一步探讨了HCFe与顺铂（CDDP）的协同作用，以克服食管鳞状细胞癌（ESCC）对CDDP的耐药性，从而深入了解分子机制，包括增强ROS生成、减少药物外流和细胞谷胱甘肽耗竭。这些发现凸显了HCFe作为多模式癌症疗法关键成分的潜力，尤其是在提高耐药性癌症化疗疗效方面（图1）。

图1：HCFe纳米酶的合成和筛选示意图及其在克服食管鳞状细胞癌 （ESCC） 化疗中顺铂耐药的应用。  

图2. a生物仿生自组装铁基纳米酶的合成示意图。b通过DFT计算确定HCFe纳米酶的组装过程以及关键结构单元之间相互作用的定量。Eb是指两个分子之间的结合能，计算方法是复合物与单独分离的分子之间的能量差。在球棍模型中，橙色、黄色、蓝色、红色和灰白色的球分别代表铁、S、N、O和C元素。d热图用于比较生物仿生自组装铁基纳米酶的归一化反应速度。

图3. HCFe纳米酶的代表性TEM图像（a）、电子图像（b）和EDS元素图谱（c）。d代表性AC HAADF-STEM图像。e Fe 2p XPS光谱。i归一化的Fe K-edge XANES。来自Fe-foil（k）、Fe₂O₃（l）、hemin（m）、FeS2（n）和HCFe nanozyme（o）的Fe K-edge的WT图像。

图4.a, b HCFe纳米酶、hemin +半胱氨酸+ Fe²⁺ 混合物、HCFe上清液、hemin、Fmoc-l-半胱氨酸或Fe²⁺ 催化的TMB比色反应在pH 4.5（a）和pH 6. 5（b）（n = 3个独立实验）。c、d在含有HCFe纳米酶、hemin +半胱氨酸+ Fe²⁺ 混合物、HCFe上清液、hemin、Fmoc-l-半胱氨酸或Fe²⁺ 的H₂O₂ 溶液中产生的O₂ 在pH 6.5（c）和pH 7. e HCFe纳米酶在pH 6.5或pH 7.4时催化TMB比色反应的反应时间曲线（n = 3个独立实验）。f在pH 6.5或pH 7.4条件下，HCFe纳米酶催化H₂O₂ 溶液中生成的溶解O₂（n = 3个独立实验）。g仅在pH 6.5条件下，HCFe纳米酶催化H₂O₂ 生成-OH的示意图，在BioRender中绘制。h使用DMPO作为自旋捕获剂检测HCFe纳米酶在pH 6.5和pH 7.4时的-OH的ESR光谱。i比较HCFe和HHFe在pH 6.5时的POD 样活性和CAT样活性。k EC109细胞经HCFe和HHFe纳米酶处理48 h后的细胞活力（n = 3个独立实验，P值用双向方差分析确定）。l BioRender中绘制的HCFe纳米酶和HHFe纳米酶在肿瘤细胞中催化H₂O₂ 的示意图。

图5.a H₂O₂歧化反应的总反应和两个半反应的方程式，以及20氨基酸配位海明相对于正常氢电极的HOMO和LUMO能级电位。b基于自然群体分析计算的20氨基酸配位海明中铁原子的NPA电荷。c HOMO介导的纳米酶的POD和CAT类活性机制。d 20个氨基酸配位的海明的POD类活性与Gads,OH的火山图（以eV为单位）。e海明-半胱氨酸的CAT和POD机制的催化循环和相应的自由能曲线（以eV为单位）。

图6.a在BioRender中创建的CDDP抗性ESCC细胞系的建立示意图。b EC109和EC109DDP、c EC9706和EC9706DDP、d TE1和TE1DDP细胞经CDDP处理48小时后的细胞活力（n = 3个独立实验）。e EC109DDP和EC109细胞的差异表达基因（DEGs）通过RNA-seq测定（n = 3个独立实验）。f EC109DDP和EC109细胞的相关DEGs（n = 3个独立实验，P值通过双尾非配对学生t检验确定。g通过ICP MS测定与CDDP（10μM）孵育5小时的抗CDDP细胞（EC109DDP、EC9706DDP和TE1DDP）和母本细胞（EC109、EC9706和TE1）的细胞内Pt浓度（n = 3个独立实验，p值通过双尾非配对学生t检验确定）。h CDDP耐药细胞和母细胞的细胞GSH水平（n = 3个独立实验，p值采用双尾非配对学生t检验）。i CDDP耐药细胞和母细胞中MRP2、Nrf2和GPX4表达的Western印迹分析。

图7.d CDDP和HCFe纳米酶对EC109DDP、EC9706DDP和TE1DDP细胞的联合指数（CI）（CI < 1：协同作用；CI = 1：相加作用；CI > 1：拮抗作用）。e用RNA-seq测定经PBS、5μM CDDP、75μg/mL HCFe和5μM CDDP + 75μg/mL HCFe处理48小时的EC109DDP细胞的差异表达基因（DEGs）。f不同处理后EC109DDP细胞中ABC转运体家族基因的表达水平（p值由单向方差分析确定。g EC109DDP细胞经不同处理6 h后产生的ROS。h EC109DDP细胞经150μg/mL HCFe处理6 h、12 h和24 h后线粒体膜电位（MMP）的变化，通过JC-1染色评估（红色：JC-1聚合物；绿色：JC-1单体）。i处理24小时后EC109DDP细胞中的ATP含量分析。(j、k对EC109DDP细胞中磷酸化的NF-κB、NF-κB和MRP2进行Western印迹分析（j）和定量评估（k）（p值由双向方差分析确定）。l EC109DDP细胞中的铂外流和m细胞内GSH水平（p值由单因素方差分析确定）。n, o处理24小时后，对EC109DDP细胞中的γ-H2AX和裂解-caspase 3表达进行Western印迹和定量分析（p值由双因素方差分析确定）。

图8. a健康雌性BALB/c小鼠静脉注射2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg CDDP当量或20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg HCFe当量的CDDP、HCFe纳米酶和CDDP + HCFe纳米酶后的体重变化（n =每组3只小鼠）。b-e健康雌性BALB/c小鼠注射生理盐水、2.5 mg/kg CDDP、50 mg/kg HCFe纳米酶或2.5 mg/kg CDDP + 50 mg/kg HCFe纳米酶14天后的血清生化数据。5 mg/kg CDDP、50 mg/kg HCFe nanozyme或2.5 mg/kg CDDP + 50 mg/kg HCFe纳米酶14 d后的血清生化数据。AST和ALT代表肝功能，UREA和CREA代表肾功能（n =每组3只小鼠）。f在BioRender中创建的CDDP抗性ESCC肿瘤模型和相应治疗方案的建立示意图。g-k首次给药后的肿瘤生长曲线（每组n = 5只小鼠，p值用双向方差分析确定）。l不同治疗组的肿瘤照片和m体重（每组n = 5只小鼠，p值用单向方差分析确定）。5 mg/kg CDDP + 50 mg/kg HCFe纳米酶（每组n = 5只小鼠）。o不同治疗组雌性肿瘤小鼠的生存曲线（每组n = 5只小鼠，与生理盐水组相比，P值通过对数秩Mantel-Cox检验确定）。

论文链接（DOI）：

申明：本微信号转发内容仅做学术交流使用，不作为商业用途，也不代表支持或赞同其观点，如涉及知识产权保护问题或其他方面的问题请及时联系小编，我们会尽快协调处理。本微信号原创文章版权归本微信号所有，欢迎分享到朋友圈等非媒体上。