抗二神经节苷（GD2）抗体治疗为神经母细胞瘤患者提供了临床益处，但免疫抑制肿瘤微环境可能损害疗效。之前已经定义了肿瘤内铜水平和免疫逃避之间的联系。在这里，报道了辅助铜螯合增强了抗gd2抗体治疗，从而在神经母细胞瘤的免疫活性模型中提供了持久的肿瘤控制。机制研究表明，铜螯合通过增强fc受体携带细胞的浸润和活性，特别是中性粒细胞，创造了一个免疫受体的肿瘤微环境，而中性粒细胞正在成为抗体治疗的关键效应物此外，神经母细胞瘤隔离铜可减弱中性粒细胞的功能，使用铜螯合可以成功逆转铜，以增加促炎效应功能。重要的是，重新将临床批准的铜螯合剂Cuprior作为一种无毒、有效的免疫调节策略。总之，研究结果为Cupprior作为辅助剂的临床试验提供了证据，以提高抗gd2抗体治疗的活性，并改善神经母细胞瘤患者的预后。该研究以题为“Copper chelation redirects neutrophil function to enhance anti-GD2 antibody therapy in neuroblastoma” 发表在Nature communications上。
神经母细胞瘤是交感神经系统的一种恶性肿瘤，占所有儿童癌症相关死亡的15%。尽管强化了多模式治疗，高危患者的预后仍然很差。虽然将抗二神经节苷（GD2）抗体（如dinutuximab）整合到维持治疗中已被证明可以显著提高生存率，现在已成为一种标准治疗，但近一半的患者仍存在难治性或产生治疗耐药性。此外，大多数幸存者表现出晚期死亡、继发性恶性肿瘤和其他慢性健康状况的风险增加。因此，提高收到的长期疗效这种有前途的免疫疗法仍然是一个重要的未解决的挑战。GD2是一种肿瘤抗原，是大多数神经母细胞瘤普遍表达的，抗GD2疗法通过表达fc的免疫效应物促进抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）。自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞被认为是ADCC的主要介质；然而，中性粒细胞正在成为实现几种癌症类型的有效反应的关键角色，包括神经母细胞瘤。神经母细胞瘤具有免疫抑制的肿瘤微环境，因此现在认为联合策略更有可能成功恢复抗gd2治疗应答所需的抗肿瘤免疫。在一些恶性肿瘤中，细胞内铜水平升高，这表明铜稳态是一种肿瘤依赖性，可能作为治疗靶点。关于神经母细胞瘤，之前报道了在神经母细胞瘤的临床样本和临床前模型中，高强度铜转运体1（CTR1）水平升高，最近也证实了肿瘤内铜水平调节免疫检查点分子程序性死亡配体1（PD-L1）的表达。使用包括四乙烯苯他胺（TEPA）在内的螯合剂消耗铜可降低肿瘤PD-L1表达，增加CD8+细胞毒性T和NK细胞浸润，并提高生存率。这些观察结果促使评估铜螯合作为一种潜在的治疗策略，通过广泛重塑神经母细胞瘤肿瘤微环境。
在本研究中，作者报道了铜螯合是一种有效的增强两种临床前免疫活性模型（Th-MYCN；NXS2）的辅助策略。铜螯合可以有利地改变淋巴细胞和髓系腔室的浸润和抗肿瘤活性，特别是中性粒细胞。描述了一种肿瘤免疫逃避的机制，其中铜隔离驱动中性粒细胞功能障碍。重要的是，建立了TETA（三乙基四胺，销售为Cuprior），一种fda批准的用于威尔逊病的铜螯合剂，作为一种创新的免疫调节剂，重新作为抗gd2治疗的辅助剂。总之，他们的发现为这种基于免疫的联合治疗神经母细胞瘤患者的临床测试提供了关键证据。
图1|铜螯合增强了抗gd2免疫治疗的抗肿瘤活性。a 这是一个实验性的设计和给药策略。b Th-MYCN小鼠的个体肿瘤动力学。c(b).中Th-MYCN小鼠的Kaplan-Meier生存曲线使用双尾Mantel-Cox对数秩检验计算统计两两比较，p值如图所示。d合并OPAL多重免疫荧光光谱的代表性图像，描述Th-MYCN神经母细胞瘤组织中自然杀伤细胞（红色）、CD8+细胞毒性T细胞、CD11b细胞（黄色）、CD11b+髓系（白色）和DAPI核染色（蓝色）的肿瘤分布。e免疫细胞定量(d)为每1000个核阳性计数。
图2|铜螯合促进了免疫允许的肿瘤微环境。a对治疗1周后获得的外周血和肿瘤的Th-MYCN模型的实验设计和给药策略。b来自对照组和TEPA处理小鼠的血清和肿瘤裂解物中的细胞因子水平。血清数据（不包括TGF-β）以平均±SEM，n=4（两组）生物重复，一个独立的实验表示。肿瘤微环境（TME）数据（不包括TGF-β）以平均± SEM、n=10（对照）和n = 6（TEPA）生物重复，一个独立实验。TGF-β血清和TME数据以平均± SEM、n=7（两组）生物重复、两个独立实验表示。c流式细胞术分析治疗1周后肿瘤的髓系亚群频率。数据以平均±SEM，n=3（两组）生物重复，一个独立的实验表示。显著性的计算使用双尾t检验和Welch的修正，p值如图所示。d在(c).中绘制的肿瘤中CD11b+ Ly6G+中性粒细胞频率的代表性流式细胞术图e从对照组和经TEPA处理的小鼠中获得的循环中性粒细胞的计数和百分比。
图3|铜螯合通过促炎信号重新增强抗肿瘤免疫。包含对照和TEPA处理的Th-MYCN肿瘤核心的组织芯片的代表性图像（=10/治疗，生物复制，总= 20核；一个独立实验），0、3或7天后切除纳米弦GeoMx数字空间分析，用荧光偶联抗体染色PanCK（红色），平滑肌肌动蛋白（黄色），CD45（绿色），DAPI核染色（蓝色）。比例尺，300µm。一个独立的实验。bTh-MYCN肿瘤核心的桑基图，显示cd45浸润的低/高感兴趣区域的分布，与治疗组和持续时间相对应。.c在TEPA处理的高与低感兴趣区域中，基因上调和下调的火山图。错误发现率（FDR）采用双尾本贾米尼-霍赫伯格程序进行调整。阈值： p < 0.1；|log2FC | > 0.5。d对TEPA处理的高浸润肿瘤区域与低浸润区域的基因集富集分析，以条形图表示。e(d)中选定通路的网络表示，显示差异表达的基因为分支。使用彩色节点报告为log2FC。缩写： FC折叠变化，PanCK全细胞角蛋白。
图4.神经母细胞瘤肿瘤微环境对铜螯合疗法敏感，并促进中性粒细胞浸润。a单细胞RNA测序的实验设计和肿瘤处理工作流程。b肿瘤室（13544个细胞）中整合样本的均匀流形近似和投影（UMAP）表示，按治疗组着色。c与细胞内铜水平（Mt1、Mt2）和神经母细胞瘤癌基因Mycn相关的基因表达水平的Violin图，按治疗组划分。d使用fgsea软件包对HALLMARK_MYC_-TARGS_V1进行基因集富集分析图。e根据治疗组分割免疫细胞室（12127个细胞）的UMAP表示，并用注释的免疫亚群着色。f（e）中所示免疫细胞亚群比例的柱状图g基因表达的点图。
图5 .中性粒细胞取代致瘤信号，推动抗肿瘤免疫的重新激活。与对照组相比，TEPA处理的免疫细胞簇中相对激动的通路的过度表达分析，使用单细胞RNA测序表示为具有相关基因分支的节点。b对照和TEPA处理的单细胞样本中聚集的细胞间通信网络的圆形图。边缘宽度与细胞类型之间的配体受体相互作用的数量成正比。c散点图，比较对照和TEPA处理样品之间的传出和传入相互作用强度。
图6|铜螯合通过铜动员促进中性粒细胞的浸润和n1极化，从而发挥抗肿瘤反应。a比较免疫细胞簇内不同治疗组中与铜代谢相关的基因的平均表达量的热图。b与中性粒细胞簇内迁移和外渗相关的基因的治疗组间log2FC表达的热图。与对照组相比的(c) N1抗肿瘤或(d) N2致瘤中性粒细胞表型相关基因的log2FC表达的热图。TEPA治疗的中性粒细胞簇内的Th-MYCN肿瘤。（a-d）中的数据来自单细胞RNA测序，并对相关细胞值进行平均值和缩放。e基因集合富集分析显示，在TEPA处理的中性粒细胞中相对富集的顶级通路。“N1_ANTI_-肿瘤中性粒细胞”签名是利用(b).中列出的n1相关基因构建的f神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE (2)-C转染编码tgfp标记的MT1X蛋白的质粒，经过TEPA处理24小时后的细胞细胞成像（10×目标）。从一个独立的实验中获得的具有代表性的图像。比例尺，100µm。g从健康供体中分离出的原始中性粒细胞孵育30 min前后，条件培养基中铜的浓度。数据以平均± SEM、n=4/条件、生物复制（健康供体）、三个独立实验表示。显著性计算采用双尾配对t检验，p值如图所示。h qRTPCR分析在条件培养基中孵育30 min后获得的与细胞内铜（MT1X）、迁移（S100A8）和促炎激活（ISG15）相关的基因的表达，如(e)。数据以平均值表示，n = 2个生物重复（健康供体），一个独立的实验。i中性粒细胞向未经处理或TEPA处理的SK-N-BE (2)-C细胞的Transwell迁移实验。使用流式细胞术计数迁移的中性粒细胞，并计算相对于输入细胞的迁移百分比。j使用从健康供体分离的中性粒细胞对凯利神经母细胞瘤细胞系进行抗体依赖性细胞毒性试验，存在抗gd2抗体（1µg/ml），8小时后定量caspase 3/7活性。
图7.铜螯合剂TETA与抗gd2治疗协同介导神经母细胞瘤同基因NXS2模型的抗肿瘤活性。a涉及A/J小鼠皮下接种NXS2细胞的神经母细胞瘤同基因模型中的肿瘤生长动力学。接种后1周开始治疗（黑色箭头），在采集血液和肿瘤前口服生理盐水（对照）或TETA（400mg/kg/天）7天。数据以平均±SEM，n=6（对照）和n = 7（TETA）生物重复，两个独立的实验表示。b流式细胞术分析TETA治疗1周后NXS2肿瘤中的中性粒细胞频率。数据以平均±SEM，n=4（两组）生物重复，一个独立实验。显著性计算采用双尾Mann-WhitneyU检验，p值如图所示。c同基因NXS2→A/J临床前模型的实验设计及免疫联合给药策略. 对于（d-f），箭头表示治疗时间。d从接种日期开始测量的荷瘤小鼠的相对体重变化。e从接种日期开始测量的单个肿瘤的肿瘤生长动力学。f从接种日期开始测量荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。使用双尾Mantel-Cox对数秩检验计算统计两两比较，p值如图所示。对于（d-f），数据以平均± SEM表示，n=8（所有组）生物重复，一个独立的实验。g合并OPAL多重免疫荧光光谱的代表性图像，描绘了NXS2神经母细胞瘤肿瘤组织中NCR1+自然杀伤细胞、CD8+细胞毒性T细胞（红色）（黄色）、CD11b+髓系（白色）和DAPI核染色（蓝色）的肿瘤分布。比例尺，100µm。h免疫细胞定量(g)为每1000个细胞核的阳性计数。数据显示为平均±SEM，n=3（盐水+ IgG2a）；n = 4，（盐水+抗gd2，TETA+抗gd2），n = 5（TETA + IgG2a）生物重复，3个技术重复，1个独立实验。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-54689-x
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