年龄相关性黄斑变性（AMD）已成为一种全球性的老年性疾病，频繁的玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（抗– VEGF）是临床上的主流治疗方法，但这种方法会引发危及视力的并发症。在此项研究中，尼达尼布（一种血管生成抑制剂）和叶黄素（一种强效抗氧化剂）能够通过多种非共价相互作用共组装成纳米颗粒。共组装的叶黄素 / 尼达尼布纳米颗粒（L/N NPs）展现出显著提升的稳定性，并且能够在小鼠体内实现两种药物至少两个月的长期缓释。在具有更完整屏障系统的兔眼球中，L/N NPs 仍可在视网膜和脉络膜成功分布达一个月之久。在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管模型中，通过微创的结膜下给药后，L/N NPs 能够成功抑制血管生成，并且取得了与标准的玻璃体内注射抗 - VEGF 相当甚至更好的治疗效果。因此，结膜下注射具有长期缓释药物行为的 L/N NPs 代表了一种很有前景且创新的 AMD 治疗策略。这种微创给药方式以及有效抑制血管生成、减轻炎症和对抗氧化应激的能力，对于改善 AMD 患者的治疗效果以及生活质量有着巨大的潜力，为深受这种致盲性眼病困扰的患者带来了希望。该研究以题为“Emerging Co-Assembled and Sustained Released Natural Medicinal Nanoparticles for Multitarget Therapy of
Choroidal Neovascularization” 发表在Advanced Materials上。
骨年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种多因素、进行性、退行性且难以治愈的疾病。随着患者数量的不断增加，对有效治疗方法的需求也持续上升。最令人担忧的问题源于AMD复杂的发病机制，其与氧化应激、补体激活以及其他持续性慢性炎症反应相关，导致脉络膜毛细血管内皮细胞的丢失和退化。发病期间血管内皮生长因子（VEGF）持续分泌，致使视网膜色素上皮（RPE）屏障破坏以及新生血管增生。因此，玻璃体内注射抗-VEGF抗体是防止AMD进一步恶化的一线治疗方法。然而，仍有部分AMD患者对抗-VEGF治疗无反应。此外，由于担心眼内炎、视网膜脱离和眼压升高等潜在风险，大多数患者对频繁的玻璃体内注射依从性较低。因此，迫切需要开发基于无创药物递送技术以及长期缓释和多功能配方的高依从性策略，以有效对抗AMD复杂的发病机制。
尼达尼布是一种用于治疗肺纤维化的一线药物，它通过抑制非受体酪氨酸激酶以及多种受体酪氨酸激酶发挥作用，同时也是血管内皮生长因子受体（VEGFR）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）和血小板源性生长因子受体（PDGFR）的有效抑制剂。此外，叶黄素是一种亲脂性维生素，能够抵御紫外线辐射，并且具备很强的抗氧化能力，可减少视网膜中的活性氧（ROS），防止氧化应激对正常细胞造成损害。因此，上述这两种天然药物在通过抑制包括纤维化、血管生成、慢性炎症以及氧化应激在内的多种致病因素来治疗 AMD 方面，都展现出了极大的潜力，是理想的候选药物。
考虑到尼达尼布溶解性较差以及叶黄素稳定性不足，容易受氧气、光照、热量、金属离子和酸碱度的影响，作者尝试将这两种天然药物“捆绑”在一起，以对抗溶解性差和不稳定的问题。经过优化比例的叶黄素和尼达尼布能够通过多种非共价相互作用（包括静电相互作用、π共轭、氢键以及疏水相互作用）成功共组装成稳定的叶黄素/尼达尼布纳米颗粒（L/N NPs）。与单独的尼达尼布和叶黄素单体相比，共组装的L/N NPs展现出了极大提升的长期胶体稳定性、光稳定性和热稳定性，这使得该纳米颗粒成为具备缓释特性的理想候选药物，可用于年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗。
L/N NPs在小鼠体内的释放时间至少延长了两个月，此外，L/N NPs在兔的视网膜和脉络膜中成功驻留一个月。由于叶黄素和尼达尼布在眼底的出色留存以及在抑制血管生成、减轻炎症和对抗氧化应激方面的多功能性，L/N NPs在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（CNV）模型中取得了卓越的治疗效果，为传统治疗策略提供了一种潜在的替代方案。因此，由于L/N NPs具有出色的生物相容性以及显著的抑制新生血管形成和慢性炎症的能力，其可能成为AMD治疗颇具前景的候选药物（图1）。
图1.用于脉络膜新生血管（CNV）多靶点治疗的具有长期缓释作用的共组装叶黄素/尼达尼布纳米颗粒（L/N NPs）示意图。通过微创的结膜下注射方式给予共组装的L/N NPs，以实现两种药物的缓释以及在脉络膜中的有效分布。此外，所获得的具备抗血管生成、抗纤维化、抗炎和抗氧化特性的L/N NPs在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管模型中取得了卓越的治疗效果。
图2. 共组装的叶黄素/尼达尼布纳米颗粒（L/N NPs）的表征：a）叶黄素与尼达尼布摩尔比从1:10到10:1的不同配比下L/N NPs的粒径分布情况。b）体外条件下，不同叶黄素与尼达尼布配比的L/N NPs中尼达尼布的累积释放行为。c）叶黄素与尼达尼布摩尔比为1:1时L/N NPs的透射电子显微镜（TEM）成像。d）超纯水中L/N NPs以及二甲基亚砜（DMSO）中叶黄素和尼达尼布的紫外-可见吸收光谱。e）尼达尼布（i）、叶黄素（ii）以及L/N NPs（iii）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。f）在温度为37℃的条件下，经紫外线照射前后，二甲基亚砜（DMSO）中L/N NPs和LNPs + NE的吸收光谱。g）在不同时间点（在第1、3、7、14、30和60天，通过高效液相色谱法（HPLC）对小鼠结膜和眼球中的尼达尼布进行分离并测定，每组样本量\(n = 4\)），对小鼠进行L/N NPs或LNPs + NE结膜下注射后，小鼠结膜和眼球中尼达尼布的含量情况。h）在不同时间点（第0天、第3天、第1周、第2周、第1个月），兔子眼球不同部位（结膜、角膜、房水、玻璃体、视网膜、脉络膜、巩膜，每组样本量\(n = 4\)）中尼达尼布的含量情况。
图3. L/N NPs 的安全性评估：a） 通过裂隙灯显微镜观察，用磷酸盐缓冲液（PBS）、LNPs + NE 或 L/N NPs（含 8.79×10⁻³ 摩尔的叶黄素和尼达尼布，单次结膜下注射 2 微升）处理小鼠眼睛四周后，小鼠眼角膜荧光素染色的代表性图像。b）用 PBS、LNPs + NE 或 L/N NPs 处理四周后，视网膜明场的代表性图像。c）用 PBS、LNPs + NE 或 L/N NPs 处理四周后，角膜的光学相干断层扫描（OCT）图像。d）根据光学相干断层扫描（OCT）图像对视网膜厚度进行的统计分析。e）对小鼠结膜下分别注射 PBS、LNPs + NE 或 L/N NPs 四周后，小鼠眼内压（IOPs）的统计分析。f）用 PBS、LNPs + NE 或 L/N NPs 处理四周后，小鼠眼的代表性视网膜电图（ERG）波形。g、h）对 A 波和 B 波的统计分析。i）对接受不同处理的小鼠进行血液生化和全血细胞分析。检测了以下指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、白细胞（WBC）计数、红细胞（RBC）计数、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞体积分布宽度（RDW）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）以及血小板（PLT）。j）来自不同组小鼠的包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、眼睛和视网膜等不同器官的苏木精 - 伊红（H&E）染色图像。
图4. L/N NPs的多靶点治疗效果：a）在血管内皮生长因子（VEGF，10纳克/毫升）存在的情况下，用磷酸盐缓冲液（PBS）、LNPs + NE或L/N NPs孵育人脐静脉内皮细胞（HUVEC）12小时后，划痕实验中细胞迁移的代表性图像（样本量\(n = 6\)）（比例尺：2微米）。b）划痕实验的量化分析（不同时间点的伤口愈合百分比）。c）用PBS、LNPs、NE、LNPs + NE或L/N NPs孵育后，Transwell迁移实验的代表性图像以及（d）相应的统计分析（样本量\(n = 6\)）e）血管内皮生长因子（VEGF）依赖性人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成实验的代表性图像（样本量\(n = 6\)）f）管腔网格的定量分析。g）在转化生长因子-β（TGF-β，10纳克/毫升）存在的情况下，用PBS、LNPs、NE、未组装的LNPs + NE或共组装的L/N NPs孵育后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）纤维化的代表性图像。h）在过氧化氢（\(H_2O_2\)，100×10⁻⁶摩尔）存在的情况下，经不同处理（PBS、LNPs、NE、LNPs + NE或L/N NPs，样本量\(n = 6\)）后，用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）染色的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）内活性氧（ROS）的细胞内荧光强度定量分析。i）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、（j）白细胞介素-6（IL-6）、（k）白细胞介素12 - P70以及（l）干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子在不同处理后由RAW 246.7细胞分泌的浓度情况。m）L/N NPs在人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）中多靶点作用的示意图。
图5.L/N NPs对激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）的治疗效果：
a）激光诱导的脉络膜新生血管模型建立及动物实验设计示意图。实验分组包括未处理组、结膜下注射LNPs组、结膜下注射NE组、结膜下注射L/N NPs组以及玻璃体内注射抗血管内皮生长因子A（anti-VEGFA）组。b）患有脉络膜新生血管的小鼠在不同处理前后单个病变部位的荧光素眼底血管造影（FFA）代表性图像。c）通过Image J软件对患有脉络膜新生血管的小鼠新生血管渗漏的相对荧光强度以及（d）相对渗漏面积进行统计分析。e）患有脉络膜新生血管的小鼠在不同处理前后单个病变部位的光学相干断层扫描（OCT）代表性图像。箭头所指为脉络膜新生血管位置。f）通过Image J软件对脉络膜新生血管厚度进行统计分析。g）在暗视条件下，患有脉络膜新生血管的小鼠经不同处理后的代表性视网膜电图（ERG）波形反应。h）在暗视条件下，经不同处理后通过视网膜电图（ERG）测量的B波的统计分析。i）不同处理后小鼠脉络膜和视网膜中激光诱导的脉络膜新生血管的苏木精 - 伊红（H&E）染色代表性图像。虚线所指为脉络膜新生血管位置。j）不同处理后患有脉络膜新生血管的小鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）表达情况的代表性免疫荧光染色图像。
在这项研究工作中，具有强抗氧化作用的叶黄素和血管生成抑制剂尼达尼布在优化配比后，能够在静电相互作用、氢键以及π共轭力等非共价相互作用的驱动下共组装成稳定的纳米颗粒（L/N NPs）。考虑到频繁的眼内注射常常让许多患者望而却步，此处制备的L/N NPs采用了微创的结膜下注射方式给药。有趣的是，研究发现经结膜下注射的L/N NPs能够持续释放药物至少两个月，且释放出的药物能够成功分布到兔子的脉络膜中。此外，L/N NPs在小鼠长期给药后展现出了长期的胶体稳定性、光稳定性、热稳定性以及高生物相容性。因此，这种无载体的L/N NPs为实现长期缓释药物提供了一种备受期待且微创的方法，鉴于其可预测性和便利性，有望受到患者的青睐。更重要的是，L/N NPs表现出了出色的抗血管生成、抗纤维化、抗炎以及抗氧化作用，在年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗方面展现出了巨大潜力。在经典的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型中，经结膜下注射的L/N NPs能够显著抑制小鼠脉络膜新生血管的发展，比如能显著减少脉络膜新生血管的渗漏情况和厚度、改善视力损伤，同时还能减少促炎和促血管生成因子的分泌，取得了与玻璃体内注射抗血管内皮生长因子A（anti-VEGFA）相当的治疗效果。
总而言之，经结膜下注射的L/N NPs在治疗脉络膜新生血管方面展现出了卓越的治疗效果，这得益于叶黄素和尼达尼布通过持续抑制血管生成、纤维化、炎症因子以及氧化应激来逆转与脉络膜新生血管相关的慢性炎症微环境所产生的协同治疗作用。这种创新性的无载体纳米颗粒是专门为长期缓释和多靶点治疗而研发的，旨在解决患者的脱靶效应问题，并拓展小分子药物抑制剂在年龄相关性黄斑变性治疗领域的市场。
论文链接（DOI）：
https://doi.org/10.1002/adma.202314095
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