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肠道菌群失调和相关的 L-色氨酸代谢紊乱是炎症性肠病进展的关键，导致肠道屏障完整性受损。修复色氨酸代谢功能障碍已成为一种有前途的治疗策略。在此，作者通过EcN-TRP@A/G原位重新编程色氨酸代谢，封装具有增强色氨酸合成能力的工程益生菌EcN-TRP，进行持续调节，从而恢复肠道屏障功能和微生物稳态。通过高压电喷雾和液体界面自组装开发的 pH 响应双层 EcN-TRP@ A/G 微胶囊，在恶劣的胃肠道环境中保留了益生菌的活力，并促进有针对性的结肠释放。小鼠生物发光追踪显示，与裸露的 EcN-TRP 相比，EcN-TRP@A/G 的活力和分布增加了 22.84 倍。靶向代谢组学强调了 EcN-TRP@A/G 对色氨酸-吲哚途径的调节。口服 EcN-TRP@A/G 可以持续提高结肠组织中的吲哚代谢物，特别是 3-吲哚乙酸和 3-吲哚丙酸，持续时间长达 7 天。在 IBD 小鼠中，EcN-TRP@A/G 通过增强 Prevotellaceae_UCG001 和 Anaerostipes 等有益细菌丰度，同时抑制大肠杆菌等致病菌株，改善肠道通透性，减少炎症并恢复肠道微生物群。作者的研究结果提供了一种经济有效的方法，通过工程改造利用益生菌原位代谢潜力来有效治疗 IBD。该研究以题为“Rewiring Tryptophan Metabolism via Programmable Probiotic Integrated by Dual-Layered Microcapsule Protects against Inflammatory Bowel Disease in Mice” 发表在ACS NANO上。
炎症性肠病 (IBD) 是一种慢性、复发性胃肠道 (GI) 炎症性疾病，包括克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC)。1 患者通常会出现腹泻，并且可能会在粪便中观察到粘液或血液， 与慢性病例相关的结直肠癌风险增加。2 IBD 的发病机制涉及粘膜屏障功能受损、肠道免疫和肠道微生物群失调以及肠道致病性变化等多因素 代谢组，如胆汁酸、短链脂肪酸 (SCFA) 和色氨酸。3 目前的 IBD 治疗方式仅显示出有限的疗效，并且长期服用包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂在内的药物可能会导致治疗耐药和 严重的不良反应。4,5 因此，迫切需要确定治疗策略，为 IBD 的预防和治疗提供安全有效的方法。肠道微生物群的代谢物作为分子介质在宿主与微生物群相互作用中发挥着至关重要的作用。最近的研究表明，色氨酸及其代谢物可以调节肠道屏障稳态。然而，直接补充色氨酸及其代谢物对 IBD 的治疗效果 不仅寿命短且生物利用度有限，难以满足持续的治疗需求。更重要的是，它们的功效因菌群失调而受到显着损害 IBD 患者的肠道微生物群受到影响，导致各种代谢紊乱，特别是色氨酸代谢受损。因此，至关重要的是要解决 维持功能失调的色氨酸代谢的逆转以充分利用色氨酸及其吲哚代谢物在 IBD 治疗中的治疗潜力的挑战。
合成生物学和生物材料的最新进展为设计和操纵具有增强功能的益生菌提供了机会。这些先进的工程修饰使益生菌能够进行一系列研究，然而，以胃酸和消化酶为特征的恶劣胃肠道环境带来了挑战，损害了细菌活力和有针对性地输送到结肠，因此，广泛的研究工作集中在采用天然来源的食品级聚合物进行微囊化或涂层。微囊化的主要挑战包括减少孔隙率以防止过早渗漏、在生理条件下实现响应性释放、精确调节尺寸和厚度以及确保最佳的生物相容性。
在这项工作中，作者构建了一种工程益生菌 EcN-TRP，其生物合成色氨酸的能力增强。使用 FDA 批准的食品添加剂，通过高压电喷雾和液体界面自组装相结合的两步工艺对其进行进一步加工，生产 EcN-TRP@A/G 双层微胶囊。EcN-TRP@A/G 具有薄而耐酸的保护壳，可保护 ECN-TRP 免受极端 pH 值和胆汁盐的影响，从而在结肠中实现定向释放，从而充当原位重新连接异常色氨酸代谢的“微引擎”（Scheme 1所示）。口服 EcNTRP@A/G 会导致结肠中色氨酸及其吲哚代谢物持续增加。IBD 小鼠模型的体内研究表明，EcN-TRP@A/G 可减轻 IBD 相关症状并减少氧化应激和组织炎症。此外，它还能促进肠道屏障功能并恢复肠道共生。我们共同证明了封装在微胶囊中的基因工程益生菌作为安全有效的 IBD 治疗方法的潜力。
Scheme 1.通过双层微胶囊集成的可编程益生菌重新连接色氨酸代谢，可预防小鼠炎症性肠病
图 1. EcN-TRP@A/G 的建立和表征。(a) EcN-TRP基因编辑过程示意图。(b) 不同菌株的电泳图。(c) trpE 突变的测序峰图。(d) 色氨酸发酵产率。n = 3。(e)EcN-TRP@A 和 EcN-TRP@A/G 的光学图像。(f) 微胶囊的共焦图像。(g) 微胶囊的SEM和相应的放大图像。(h) 浸入不同模拟消化物中的 EcN-TRP@A/G 的 SEM 图像。(i, j) 微胶囊的尺寸分布。(k)细胞毒性测定。数据记录为平均值±标准差。
图2. EcN-TRP@A/G的保护作用及其体内色氨酸生产能力。(a) SGF、SIF 和 SCF 中 EcN-EGFP@A/G-Dil 的代表性荧光显微镜图像。比例尺：50 μm。(b)微胶囊的粒径变化。(c, d) 不同模拟消化物和计数结果中 EcN-TRP、EcN-TRP@A 和 EcN-TRP@A/G 的菌落。n = 3。（e）小鼠及其胃肠道的 IVIS 生物发光图像。n = 3。(f−i) 口服后不同时间点GI含量的菌落计数。n = 3。(j) 体内色氨酸生产能力测定方案。(k−m)小鼠结肠中TRP、IPA和IAA的含量。
图 3. EcN-TRP@A/G 的剂量筛选。(a) 建模和给药示意图。(b) 与初始体重相比，小鼠每日体重的百分比变化。(c)全过程疾病活动指数。（d，f）每组小鼠结肠的宏观照片及其相应的定量结果。（e，g）小鼠结肠的 H&E 切片和相应的组织病理学评分。n = 6 个随机选择的光场。(h−j) 不同组结肠中色氨酸和吲哚产物的水平。
图 4. EcN-TRP@A/G 的生物相容性评估。(a)生物相容性测试示意图。(b)记录小鼠体重的每日变化。n = 5。（c，d）宏观图像和相应的量化结肠长度。n = 5。(e−j) 全血检测指标。n = 5. (k−o) 血清生化检测指标。GOT：谷草酰乙酸转氨酶；GPT：谷氨酸丙酮酸转氨酶；ALB：白蛋白；BUN：血尿素氮；CREA：肌酐。n = 5。(p) 小鼠关键器官组织的 H&E 染色。比例尺：50 μm。
图 5. EcN-TRP@A/G 对 DSS 诱导的小鼠 IBD 的预防功能。(a) DSS 诱导的小鼠 IBD 和治疗方案示意图。(b) 每日体重。n = 5。(c) DAI。n = 5。(d, f) 结肠图像和量化长度。n = 5。(e) 代表性 H&E 部分。比例尺，上方：200 μm，下方：100 μm。(g)结肠组织病理学评分。n = 6 个随机选择的光场。(h, i) 结肠组织中的 MDA 和 MPO 活性。n = 5。(j−m) 结肠中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的水平。n = 5。数据记录为平均值±标准差。
图 6. EcN-TRP@A/G 改善色氨酸代谢并恢复肠道屏障功能。(a) 正交最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 图。n = 5。（b，c）不同组的差异代谢物条形图。n = 5。(d) 代谢物相对含量的热图。n = 5。(e) 代谢物数据集的箱线图。n = 5。(f−h) 结肠中 TRP、IAA 和 IPA 的水平。n = 5。（i，j）ZO-1 和 occludin 的免疫荧光图像和半定量（橙色：ZO-1/occludin，蓝色：细胞核；比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。(k, l) MUC2 和 MPO 的免疫组织化学图像和半定量（比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。(m) TUNEL 染色图像及其定量（绿色：TUNEL，蓝色：细胞核，比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。
图 7.EcN-TRP@A/G 对 DSS 诱导的小鼠 IBD 的治疗效果。(a) IBD 小鼠的构建和治疗的实验时间表。PBS、DSS、DSS+EcN@A/G 和 DSS+EcN-TRP@A/G 组中 n = 5；TRP、A/G 和 VSL#3 组中 n = 4。(b) 每日体重。(c) DAI。(d, f) 结肠图像和定量。(e) 代表性 H&E 结肠切片。比例尺，上方：200 μm，下方：100 μm。(g)结肠组织病理学评分。n = 6 个随机选择的光场。(h, i) 结肠组织中的 MDA 和 MPO 活性。(j−m)结肠中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平。
图 8. EcN-TRP@A/G 对 TNBS 诱导的小鼠 IBD 的治疗效果评估。(a) TNBS 引起的 IBD 和治疗过程的示意图。(b)体重变化。n = 5。(c) DAI。n = 5。（d，h）结肠的宏观图像。n = 5。(e) 每组的 H&E 染色图像。比例尺，上方：200 μm，下方：100 μm。(f)不同组的生存曲线。n = 8。（g）血清中 FITC-葡聚糖的浓度。n = 3。（i）不同给药后小鼠结肠的组织病理学评分。n = 6 个随机选择的光场。(j, k) 小鼠结肠中的 MDA 和 MPO 活性。n = 5。(l−o) 小鼠结肠组织中促炎细胞因子的浓度。
图 9. EcN-TRP@A/G 恢复肠道屏障功能。(a−c) 结肠中 TRP、IAA 和 IPA 的水平。n = 5。(d) 血清中 FITC 葡聚糖的水平。n = 3。(e)结肠组织中ZO-1和occludin的相对mRNA表达。n = 3。（f）小鼠中ZO-1和occludin的蛋白表达，以及通过光密度测定法定量（g）。n = 3。（h，i）ZO-1 和 occludin 的免疫荧光图像和定量（l，m）（橙色：ZO-1/occludin，蓝色：细胞核，比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。(j) MUC2 的免疫组织化学图像和定量 (n)（比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。(k, o) TUNEL 图像和定量（绿色：TUNEL，蓝色：细胞核，比例尺：50 μm）。n = 6 个随机选择的光场。
图 10.EcN-TRP@A/G 调节肠道微生物群。(a−d) 不同群体的α多样性。(e) 主坐标分析 (PCoA) 的 β 多样性。（f，g）分别为门和属水平的肠道菌群组成。(h) 组间维恩图。(i，j)LDA效应大小(LEfSe)分析的分支图和线性判别分析(LDA)。(k−o) 属水平上肠道微生物的相对丰度。n = 6。数据记录为平均值±标准差。
这项研究开发了一种用于 IBD 治疗的工程益生菌微胶囊系统 (EcN-TRP@A/G)，该系统能够通过吲哚途径对结肠内色氨酸的合成和代谢进行原位重编程。微球中藻酸盐和明胶的混合双层核壳结构有助于将 EcN-TRP 靶向递送至结肠，同时保护其免受极端胃肠道条件的影响。EcN-TRP@A/G通过自身产生吲哚衍生物或通过与其他肠道微生物相互作用来促进肠道屏障修复，从而减少有害物质穿过肠道屏障，缓解炎症浸润，减轻氧化应激，减少肠上皮细胞凋亡。此外，我们的数据表明，EcNTRP@A/G 可以通过增加微生物多样性和有益细菌的相对丰度，同时减少致病菌的富集来恢复 IBD 小鼠的肠道微生物群稳态。此外，将电喷雾和液体界面自组装两步温和工艺巧妙地结合起来构建微胶囊，提供了一个具有成本效益的“3S”平台（简单、可扩展和安全），有望促进临床应用 封装生物活性物质的翻译。总体而言，原位色氨酸和微生物群重编程系统提出了一个概念和一个适应性平台作为 IBD 治疗的候选方案。
论文链接（DOI）：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.
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