南开大学朱春雷团队《AFM》：pH响应表面电荷可切换的纳米系统用于增强生物膜穿透力实现糖尿病伤口的光动力与抗生素疗法的协同治疗

摘要

慢性伤口，尤其是与糖尿病相关的伤口，由于其易形成抵抗传统抗生素治疗的生物膜，构成了重大的临床挑战。为了解决这一问题，该团队提出了一种新颖的治疗策略，即利用负载有聚集诱导发光光敏剂和天然饱和脂肪酸（AIE/LA@HMONs−PyB）的pH响应性纳米粒子，以实现有效的生物膜穿透和破坏。在生理条件下，AIE/LA@HMONs−PyB带负电荷。然而，当它们积聚在感染部位时，AIE/LA@HMONs−PyB表面的吡啶甜菜碱基团能够在酸性的生物膜微环境中迅速质子化并发生电荷反转，从而增强其穿透生物膜的能力。在光照下，这些纳米粒子会产生活性氧，有效破坏生物膜结构。这一过程使得较低浓度的环丙沙星能够发挥协同作用，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜实现了高达99.99%的体外抗菌效率。此外，在糖尿病伤口的动物模型中，这种协同疗法通过减轻炎症、促进血管生成和增强胶原蛋白再生，加速了伤口愈合。这种增强的穿透策略显著提高了这种联合治疗方法的治疗效果，为慢性伤口愈合的进步和患者预后的改善带来了巨大希望。该研究以题为“A pH-Responsive, Surface Charge-Switchable Nanosystem with Enhanced Biofilm Penetration for Synergistic Photodynamic and Antibiotic Therapy of Diabetic Wounds” 发表在Advanced Functional Materials上。

生物膜创造了一个与正常组织显著不同的微环境，表现出独特的物理化学性质。一个显著的特征是酸性微环境的形成，这是由细菌碳水化合物代谢的副产物和细胞外DNA的存在所导致的。为了利用这种酸性特性，pH响应性、表面电荷可切换的纳米粒子已成为一种有前景的治疗策略。已开发出各种嫁接有pH响应性基团的纳米粒子，以特异性地靶向酸性生物膜微环境。其中，吡啶甜菜碱衍生物因其在酸性条件下能迅速质子化而特别值得关注。这种穿透机制不仅显示出克服生物膜穿透障碍的潜力，而且有望彻底改变生物膜相关感染的治疗方式。光动力疗法（PDT）被认为是治疗细菌生物膜感染的一种有前景的方法，具有非侵入性、精确的时空控制、深层组织穿透和最小药物耐药性等优点。PDT通过光激活光敏剂（PS），进而使氧气敏化产生活性氧（ROS）。这些ROS诱导氧化应激，导致细菌死亡。为了增强PDT在根除生物膜方面的疗效，将PS封装在表面电荷可切换的纳米粒子中是至关重要的，因为这提高了治疗指数。在此背景下，聚集诱导发光（AIE）PS代表了一项重大进展，因为它们克服了传统PS的局限性，传统PS常因分子间π-π堆积而降低光敏化作用。值得注意的是，将PDT与其他治疗方式（如化疗，即抗生素）相结合可以产生协同效应，增强生物膜的根除效果并减轻抗生素耐药性。具体而言，PDT可以增加细菌对抗生素的敏感性，从而可能降低灭活细菌所需的剂量。这种联合方法不仅减轻了身体负担，还有助于在治疗感染的同时调节免疫功能。因此，将表面电荷可切换的PDT纳米系统与抗生素治疗相结合，为治疗细菌生物膜感染提供了一种开创性和有效的策略，代表了对抗抗生素耐药性和生物膜抗性的新前沿。

研究概况

在本研究中，该团队开发了一种pH响应性、表面电荷可切换的光动力纳米系统，并将其与抗生素治疗相结合，创建了一种用于治疗与生物膜感染相关的慢性伤口的组合治疗策略（方案1）。首先，制备了功能化的中空介孔有机硅纳米粒子（HMONs-PyB），其表面修饰了吡啶甜菜碱衍生物，以在酸性条件下实现快速质子化，从而增强穿透力。接下来，将AIE PS和天然饱和脂肪酸（NSFA；即月桂酸（LA））物理共封装到HMONs-PyB中，形成光动力纳米系统（记为AIE/LA@HMONs-PyB）。封装的AIE PS在LA中被迫形成自聚集体，由于LA的高结晶性，这限制了AIE PS的分子内运动，从而增强了其光敏化能力，放大了PDT效果。通过利用生物膜内的pH梯度，这些纳米粒子逐渐发生质子化，增强了它们穿透到pH更低的深层生物膜层的能力。PDT介导的杀菌作用显著减少了细菌数量并破坏了生物膜的结构完整性。这种破坏使内部细菌暴露于外部环境，从而增加了它们对抗生素的敏感性。如预期所料，随后引入抗生素（即环丙沙星（CIP））更有效地灭活了嵌入的细菌。该纳米系统在体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（S. aureus；MRSA）生物膜表现出卓越的治疗效果，实现了99.99%的抗菌效率。更重要的是，它在糖尿病小鼠模型中显著促进了慢性伤口的愈合，通过减轻炎症、促进血管生成和增强胶原蛋白再生，为临床环境中有效治疗慢性伤口带来了巨大希望。

图1 示意图显示了ph响应，表面电荷可切换的纳米系统根除细菌生物膜。AIE/LA@HMONs−PyB的A)结构。B)PDT和抗生素治疗策略增强细菌根除的机制。C)对糖尿病小鼠慢性伤口中MRSA生物膜的消除。

图2 TPAI的物理化学性质。A)TPAI的化学结构。B)DMSO中TPAI的紫外-可见光谱。[TPAI] = 10 μm.C)DMSO（n=3）中甲苯组分与甲苯（f甲苯）的相对发射强度。I0为TPAI在二甲苯=为0%时的发射强度。[TPAI] = 10 μm.D)TPAI的单线态和三重态通道的能级图。E)计算了TPAI的FMOs和相应的能隙。

图3 AIE/LA@HMONs的理化性质表征。A) AIE/LA@HMONs表面官能团的化学结构。B) 四种AIE/LA@HMONs的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺：100 nm。C-F) 四种AIE/LA@HMONs的动态光散射（DLS）数据：C) AIE/LA@HMONs-OH，D) AIE/LA@HMONs-NH2，E) AIE/LA@HMONs-DA，F) AIE/LA@HMONs-PyB。G) 7天储存期间的粒径变化（n=3）。H) 不同AIE负载纳米粒子存在下，DCFH的发射增强比（I/I0）随照射时间的变化。I0表示0秒时DCFH溶液的发射强度（n=3）。[TPAI]=10 μm。I) 不同AIE负载纳米粒子存在下，DHR-123的发射增强比（I/I0）随照射时间的变化。I0表示0秒时DHR-123溶液的发射强度（n=3）。[TPAI]=10 μm。J) 不同AIE负载纳米粒子存在下，ABDA的分解速率随照射时间的变化。A0表示0秒时ABDA的吸光度（n=3）。[TPAI]=10 μm。

图4 不同pH条件下AIE/LA@HMONs的电荷逆转及其生物膜穿透试验。A)磷酸盐缓冲液中AIE MONs/LA@HMONs的Zeta电位分析（n = 3）。B)在pH = 5.5（n = 3）下连续孵育2小时后，AIE/LA@HMONs−DA的Zeta电位分析。C)在pH = 6.5（n = 3）下连续孵育10 min后，AIE/LA@HMONs−PyB的Zeta电位分析。D)用AIE/LA@HMONs处理2小时的MRSA生物膜的CLSM图像。生物膜用SYTO 9染色，显示为绿色（Ex=488nm，Em=490−540nm）。纳米颗粒通过封装的AIE PSs可见，显示为红色（Ex=638nm，Em=640−730nm）。比例尺： 100 μm。E−G)AIE/LA生物膜内HMONs的平均荧光强度为E) 0.5 h、F) 1 h和G) 2 h（n = 3）。

图4.光动力抑制体外生物膜复发。A)体外生物膜复发实验程序示意图。B)生物膜附着导管的体外模型实验程序示意图。TBTCP-PEG7、Van或超声处理前后活细菌生物膜的C) 3D荧光图像，SYTO-9染色。D)TBTCP-PEG7、Van或超声治疗前后导管附着的MRSA生物膜中的菌落平板图像。E)由(C)引起的荧光强度变化的统计图F)(D)导管附着的MRSA生物膜中活细菌计数变化的统计分析。

图5 使用AIE/LA@HMONs体外根除MRSA生物膜。A)不同处理后来自MRSA生物膜的琼脂平板上形成的菌落照片。B)对不同治疗组的细菌活力进行定量分析（n = 3）。C)不同处理后的MRSA生物膜的扫描电镜图像。比例尺：2 μm。不同处理后，用SYTO 9染色的MRSA生物膜的D) CLSM图像。比例尺：100 μm。E)不同处理后MRSA生物膜的相对荧光强度（n = 3）。F)不同处理后用CV染色的MRSA生物膜照片。G)通过CV染色测定各组MRSA生物膜的相对生物量（n = 3）。***p < 0.001。[TPAI] = 40 μm.

图6 通过PDT和抗生素联合治疗在体外根除MRSA生物膜。A)对AIE/LA@HMONs−PyB和CIP的协同棋盘格分析。B)不同处理后生物膜的琼脂平板上形成的菌落照片。C)通过对数菌落形成单位（CFU）数（n = 3）对不同组的细菌活力进行统计分析。D)不同处理后的MRSA生物膜的扫描电镜图像。比例尺：2 μm。不同处理后，用SYTO 9染色的MRSA生物膜的E) CLSM图像。比例尺：100 μm。F)不同处理后MRSA生物膜的相对荧光强度（n = 3）。G)不同处理后用CV染色的MRSA生物膜照片。H)通过CV染色测定各组MRSA生物膜的相对生物量（n = 3）。***p < 0.001。[TPAI] = 40 μm.[CIP] = 10 μg mL−1.

图7 不同处理下MRSA生物膜的转录组测序分析。A)显著下调（紫色）和上调（橙色）基因的A)火山图。采用|log2（折叠变化）|≥1和FDR≤0.05进行鉴定。B)与氧化应激、DNA合成和细菌膜相关的DEGs的热图。DEGs的C) GO途径富集分析。D)DEGs的KEGG途径富集分析。[TPAI] = 40 μm.[CIP] = 10 μg mL−1.

图8 mrsa感染小鼠糖尿病创面的体内抗生物膜行为。A)显示治疗过程的时间线的示意图。B)不同治疗后mrsa感染小鼠糖尿病创面的变化照片。比例尺：0.5 cm。C)不同治疗方法下的糖尿病创面相对感染区域（n = 5）。D)不同治疗组小鼠在治疗期间体重的变化（n = 5）。E)不同治疗组小鼠的存活率（n = 5）。F)用对数CFU数（n = 3）对不同组的细菌活力进行统计分析。G)不同组在第11天在琼脂平板上形成的菌落照片。***p < 0.001。[TPAI] = 40 μm.[CIP] = 20 μg mL−1.

图9 完成抗生物膜实验后，对不同处理后感染伤口组织的组织学分析。A) H&E和Masson三色染色的伤口组织切片。红色箭头、蓝色箭头和黄色虚线分别表示炎症区域、新的毛囊和再生的表皮。比例尺：100 μm。B)伤口组织切片中TNF-��和IL-6的代表性免疫荧光染色图像。比例尺：100 μm。C-G)定量分析伤口组织切片中C)TNF-��、D) IL-6、E) CD31、F) COL I和G) COL III的相对信号强度（n = 3）。H)伤口组织切片中CD31、COL I和COL III的代表性免疫组化染色图像。绿色箭头表示血管生成。比例尺： 100 μm。***p < 0.001

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