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摘译：陈胤儒
审校：苏佳纯
社区获得性细菌性脑膜炎是一种危及生命的感染，严重者可在48小时内死亡。感染性脑膜炎的紧急诊断目前基于多重实时扩增技术，但仅用于最常见的致病微生物，可导致预后不佳。细菌特征和耐药性分析需额外的体外检测（超过48小时），延迟了针对病原体的治疗。因此，法国马赛地中海传染病医疗和教学研究所的研究者进行了一项前瞻性研究，评估了基于脑脊液（CSF）的实时宏基因组学（RTM）对社区获得性脑膜炎病原体的鉴定、分型和易感性分析的有效性和及时性。
研究者采集了疑似社区获得性脑膜炎的52例患者的脑脊液标本，分别采用RTM法和常规实时多重RT-PCR结合细菌培养的方法进行病原菌检测（图1）。RTM生成的序列与包含12种最常见病原体的内部数据库进行实时比对，并使用在线软件EPI2ME以及NCBI数据库进行比对，进行病原体鉴定。并使用工具ResFinder和在线软件MLST进行抗菌药物敏感性和基因型预测（图2）。
在8个月的时间里，研究者采用常规多重RT-PCR在52个脑脊液样本中检查出49个阳性结果，包括肺炎链球菌（21）、脑膜炎奈瑟菌（9）、流感嗜血杆菌（8）、无乳链球菌（3）、疱疹病毒-1（3）、单核细胞增生李斯特菌（2）、大肠埃希菌（1）、金黄色葡萄球菌（1）和水痘带状疱疹病毒（1）。而RTM组结果显示与上述47个阳性样本的结果一致，2个结果不一致，分别为流感嗜血杆菌和肺炎链球菌，考虑为假阳性结果。对于剩余3份脑脊液样本两种方法均显示阴性。多重RT-PCR一般耗时90分钟，RTM耗时120分钟左右。然而在本研究中，33份CSF样本在RTM测序开始20分钟后就检测到了病原体基因组，另外14份样本也在测序2小时内检测到（图3），且在19个CSF样本中基因组覆盖率超过50%。RTM鉴定出了14种病原菌基因型。在所有16株可培养的易感细菌中，有10株菌株计算机模拟的抗菌谱与体外药敏试验一致。
尽管本研究的样本量有限，但RTM被证明在基于脑脊液样本的诊断、基因分型和细菌易感性分析等方面取得了成功。与实验室中基于多重RT-PCR的常规诊断相比，该技术在时间上已经具有竞争力。实施RTM作为威胁生命的脑膜炎的及时诊断工具，还可以提供研究地区流行的脑膜炎致病病原体变异的实时基因组监测，推动地区流行病控制和疫苗接种。
在实验室收到脑脊液样本后，进行了以下检测：a）每份样本取200µL进行多重BioFire FilmArray®试剂盒检测，并对血细胞进行定量；b）对收到的脑脊液样本均进行常规培养；c） RTM诊断在不超过4小时的总工作流程中进行；d）实时基因组鉴定直接通过MinION生成的数据对内部数据库进行blast，然后使用EPI2ME和Taxonomer在线软件对NCBI数据库进行blast；e）使用ResFinder在线数据库和MLST在线数据库对菌株耐药性和病原体基因分型进行预测
通过在服务器上使用blastn命令行将MinION reads与内部数据库直接比对，再通过Taxonomer和EPI2ME在线软件与NCBI GenBank比对，进行病原体基因组快速鉴定。当鉴定出2个病原体特异性读数时，分析被解释为阳性。为了确认病原体鉴定，在使用Galaxy Europe在线软件上的“Canu assembler”进行组装之前，用FastQC控制MinION reads的质量。利用blastn将生成的基因组片段与GenBank数据库比对，鉴定出Hit-blast菌株，并作为参考基因组使用CLC Genomics Workbench 21.0.3软件绘制MinION的总reads。在PubMLS上进行细菌基因分型，在ViPR在线数据库上进行病毒基因分型。在ResFinder和Resistance Gene Identification上预测细菌耐药性
【参考文献】
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