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摘译：王雨葭
审校：徐 溯
肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)O157:H7是食源性感染的一种常见病原体，可引起急性感染性腹泻。赖氨酸乙酰化是一种翻译后修饰，发生在各种原核生物中，受目前唯一在细菌中被发现的去乙酰酶CobB 调节。既往研究表明，CobB 介导的去乙酰化可使鼠疫耶尔森菌毒力减弱，亦可使果蝇感染模型中霍乱弧菌毒力下降。然而，CobB 是否参与 EHEC O157:H7毒力的调节尚未报道。近日发表在Gut microbes上的一篇文章使用乙酰化蛋白质组学系统地鉴定了 EHEC O157:H7中 CobB 调控的许多蛋白质，发现 CobB通过逆转EspA伴侣CesA K44位点的乙酰化来增强O157:H7的毒力。
本研究中，作者首先通过蛋白质印迹实验检测了野生株(wild type，WT)、cobB突变体(△cobB)和cobB过表达株(cobB++)在体内的乙酰化水平，证实了 CobB 是 EHEC O157:H7中的去乙酰酶(图1a)。基于CobB在多种细菌中的重要作用，作者进一步探索了CobB对细菌毒力的潜在影响。作者通过细胞黏附实验、荧光肌动蛋白染色实验和竞争性感染实验证明了CobB 的存在使得 EHEC O157:H7 的毒力增强。与 WT 相比，cobB 的缺失使黏附在 HeLa 细胞上的细菌数量减少了 2.3 倍(图1 b)，ΔcobB 菌株感染后细胞基座数减少(图1 c-d)，ΔcobB 菌株在兔结肠中的定植能力降低了约 8 倍(图1 d)。
图1（a）来自 WT、cobB 突变体（ΔcobB）和 cobB 过表达菌株（cobB++）的蛋白质裂解物中乙酰化的蛋白质印迹分析。（b）WT 和 ΔcobB 对 HeLa 细胞的粘附测定。（c）感染后3小时通过 FAS 评估 WT 和 ΔcobB 对 A/E 病变形成的检测。显示了 HeLa 细胞肌动蛋白细胞骨架（绿色）以及细菌和 HeLa 细胞的细胞核（红色）。（d）每个感染细胞基座数的FAS测定定量（n = 50）。（e）比较 ΔcobB 和 WT 在兔结肠中的定植能力的竞争测定。竞争指数（CI）定义为 ΔcobB 与 WT 的产出比除以 WT假名与 WTnadi 的输入比。（f）WT 和 ΔcobB 在 DMEM 中的生长曲线。
随后，为寻找CobB 调节的蛋白质修饰位点，作者使用乙酰化蛋白质组学显示：EHEC O157:H7 中，CesA 蛋白上K44位点的乙酰化可能受 CobB 调节。同时，在 ΔcobB 中，T3SS中EspA的分子伴侣 CesA 上 K44 位点的乙酰化增加了近 705 倍。
研究表明，CesA蛋白是EspA的分子伴侣，对维持EspA的稳定性和形成A/E病变至关重要。作者假设CesA的K44位点的乙酰化可能影响EHEC O157:H7的毒力，构建了cesA突变体(△cesA)，发现CesA对细菌毒力有显著影响：ΔcesA菌株的黏附能力下降3.8倍（图2a），FAS染色显示基座形成减少（图2b-c），且在幼兔模型中ΔcesA菌株的肠道定植能力降低7.8倍（图2d）。进一步研究发现，模拟乙酰化状态的cesA-K44Q菌株黏附和定植能力降低，而去乙酰化状态的cesA-K44R菌株与WT相似（图2a,d）。这些结果揭示了CesA的K44位点去乙酰化增强了EHEC O157:H7的毒力。
图2（a）WT、ΔcesA、cesA+、cesA-K44Q和 cesA-K44R菌株与 HeLa 细胞的黏附测定。（b） 感染后3小时，HeLa 细胞的 FAS 通过 WT、ΔcesA、cesA+、cesA-K44Q 和 cesA-K44R 检测 A/E 病变形成。显示了 HeLa 细胞肌动蛋白细胞骨架（绿色）以及细菌和 HeLa 细胞的细胞核（红色）。（c）每个感染细胞基座数的 FAS 测定定量（n = 50）。（d） WT、ΔcesA、cesA+、cesA-K44Q 和 cesA-K44R 菌株在兔结肠中的定植测定（n = 6）。
蛋白质降解实验结果表明，CesA上K44位点的乙酰化状态影响EspA的稳定性：cesA-K44Q菌株中EspA随时间降解，而cesA-K44R菌株中EspA稳定（图3a）。免疫沉淀实验显示，CesA的K44Q突变减少了与EspA的结合，K44R则无影响（图3b）。分子动力学模拟揭示，野生型CesA与EspA通过氢键稳定结合，但K44乙酰化后氢键消失（图3c）。这些发现证实，CesA的K44位点的去乙酰化有助于EspA的稳定，增强了EHEC O157:H7的毒力。
图3（a） cesA-K44Q 和 cesA-K44R 背景中 EspA 稳定性的Western blot分析。（b）EspA 与免疫沉淀纯化的 CesA-FLAG（WT）、CesA-K44Q-FLAG（K44Q）和CesA-K44R-FLAG（K44R） 相互作用的蛋白质印迹分析。（c）CesA和EspA的K44之间相互作用的结构表示。
研究者进一步在ΔcesA、双突变体ΔcobBΔcesA 和 cobB 回补菌株ΔcobB （+）ΔcesA进行CesA-FLAG 蛋白乙酰化水平的免疫沉淀试验，蛋白质印迹结果显示，CesA 蛋白的去乙酰化是由 EHEC O157:H7 中的 CobB 直接介导（图4）。细菌双杂交试验进一步 CobB 与 CesA 相互作用（图5）。这些结果表明，CobB 通过去乙酰化 CesA 来调节 EHEC O157:H7 的毒力。
图4从菌株 cesA-Flag（WT）、ΔcobBcesA-Flag（ΔcobB）和ΔcobB （+） cesA-Flag （ΔcobB+）免疫沉淀的 CesA-FLAG 蛋白乙酰化水平的蛋白质印迹和定量分析。
✦ + 点评
这篇文章揭示了大肠埃希菌O157:H7毒力调控的新机制，为理解细菌毒力调控提供了新的视角。CobB 在细菌中是一种广泛保守的蛋白质，其对毒力的调控作用在多个肠道病原体中得到证实，这些结果进一步提示我们，这一蛋白及其相关的去乙酰化可能在更广泛的病原体种属种参与细菌毒力调节。
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2331435
