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摘译：陆严研
审校：苏佳纯
图1.（a）acrIF8–aca2操纵子不同突变体的接合频率。（b）acrIF8–aca2 操纵子不同突变体的噬菌体侵染滴度。
该团队先前文章已证明Aca2在acrIF8-aca2 启动子中可与反向重复序列IR1结合以抑制转录。作者推测IR2是 acrIF8-aca2 操纵子5'非翻译区 （5'UTR） 的一部分，Aca2可与转录后mRNA序列上的IR2结合阻止翻译（图2a）。为了验证这一推测，作者将纯化的Aca2与含有IR2的RNA寡核苷酸一起孵育，通过凝胶迁移实验（EMSA）确定转录本前的60个核苷酸为靶RNA，且相互作用为剂量依赖性，解离常数为 30.2 nM（图2b-d）。基于上述结果，作者用不同长度的RNA进行EMSA竞争实验，进一步明确最小靶RNA，其序列可形成包含IR2和IR-RBS的双茎环结构（图2e-g）。
图2.（a）acrIF8启动子区序列。（b-d）凝胶迁移实验（EMSA），b为60nt，d为60nt突变体，e为不同长度的竞争RNA。（f-g）IR2和IR-RBS的双茎环结构的模拟图，共44nt。
冷冻电镜（cryo-EM）的结果进一步证明Aca2二聚体可与含有IR2和IR-RBS 的42nt双茎环RNA特异性结合，结构解析分辨率为2.6 Å（图3）。
图3.（a）Aca2二聚体结合IR2和IR-RBS双茎环RNA的冷冻电镜结构。（b）Aca2-RNA（紫色）与Aca2-DNA（白色）叠加的冷冻电镜结构。（c）Aca2-RNA绕水平轴旋转 90°的晶体结构（相较于a）以及 Aca2- RNA相互作用的关键氨基酸。（d）Aca2-DNA绕水平轴旋转 90°的晶体结构（相较于 c）以及 Aca2- DNA相互作用的关键氨基酸。（e）Aca2-RNA 复合物和Aca2-DNA 复合物中残基R30和D45的放大视图。
图4.（a）Aca2 双重调控示意图。Aca2可结合启动子区IR1来抑制 acrIF8-aca2 操纵子的转录，也可结合 5′ UTR中的双茎环结构来特异性抑制acrIF8的翻译 。（b-c）噬菌体感染的动力学模型。在转录和翻译双重调控的存在下，单个噬菌体感染后60分钟内Acrs蛋白产生速率急剧增加，然后迅速下降到恒定的低水平，而Acrs蛋白数量在随时间不断积累。（d）3种调节模式下Acrs蛋白数量的动力学模型，不受调节（左图），或仅基于 DNA（中图）或仅基于 RNA（右图）。（e）4种调节状态下噬菌体复制到多拷贝时的建模数据。（f）4种调节状态下，由不同质粒携带时acr基因产生eYFP荧光信号的建模数据。
图5.（a）含aca2 的4个代表性的操纵子。（b）含 aca2 的操纵子在细菌门的分布。（c）DNA调节基序、RNA调节的蛋白质基序和起始密码子的相对位置图。（c）调节基序存在序列和结构的保守性。（e-f）噬菌体ZF40（蓝色）和厦门希瓦氏菌（红色）中 Aca2 与互作序列之间的序列差异。
【参考文献】
点
评
这项研究表明，Aca2的HTH结构域不仅通过结合DNA抑制Acr的转录，还通过结合RNA茎环阻止核糖体进入来抑制mRNA的翻译。这种双重调控模式在Aca2家族中广泛存在，有助于在噬菌体DNA快速复制的情况下促进CRISPR–Cas抑制。
