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摘译：陈欣
审校：范亚新
近年来，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）的出现及全球范围内快速播散，对人类健康构成了极大的威胁。多黏菌素类药物被认为是治疗CRE感染的最后一道防线。然而，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药和异质性耐药（heteroresistance，HR）的出现，给临床治疗带来了困境。
肺炎克雷伯菌主要通过带正电荷的4-氨基-4-去氧-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）或磷酸乙醇胺（PEtN）修饰脂质A带负电荷的磷酸基团，使脂多糖表面总净负电荷减少，从而降低多黏菌素与细菌外膜的静电作用，继而产生耐药。这主要通过调节PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB双组分系统来实现的。
研究者收集了54株临床CRKP，以及1株标准菌株MGH78578。所有菌株对碳青霉烯类抗菌药物耐药，但对多黏菌素B敏感。群体分析法（population analysis profiling，PAP）结果显示，90.47%（49/54）分离株表现出PB-HR。
研究者从中选取了3株典型的异质性耐药菌株（B1、D1和D4）的天然群体（native population，NP）和异质性耐药亚群（heteroresistant subpopulation，HSP）进行RNA测序。结果显示，B1-HSP与B1-NP、D1-HSP与D1-NP、D4-HSP和D4-NP之间存在252个共变异基因，HSP菌株中phoP、pmrD、arnT和arnA的表达水平显著升高。除了基因的表达变化外，研究者还关注了基因间区的变化。在42个新转录本中，他们发现一种新的sRNA（sRNA686）在HSP菌株中显著增加。sRNA是调节特定条件下细胞各种生物学和生理过程的关键参与者。通常，sRNA通过与蛋白质结合从而改变其活性来发挥作用，或者通过与其靶mRNA进行碱基配对作为反义调节因子发挥作用。碱基配对sRNA可以调节转录、翻译和mRNA稳定性。大量研究表明，调节性小非编码RNA（sRNA）可以调节抗生素耐药性和敏感性。经RT-qPCR验证，临床分离的黏液型CRKP菌株K13和标准菌株MGH78578的异质性耐药亚群sRNA686表达水平也升高（图1），在其他临床CRKP菌株的HSP中，sRNA686也过表达。因此，研究者猜想sRNA686可能跟PB-HR有关，并选取了D1、K13和标准菌株MGH78578做进一步的研究。
研究者分别在野生株、sRNA686过表达株、sRNA686敲除株和phoP敲除株中进行PAP、杀菌曲线和生长曲线分析。PAP结果表明，sRNA686过表达可以提高D1、K13和MGH78578菌株的PB-HR，获得了MIC增加的耐药亚群（图2A）。杀菌曲线结果表明，sRNA686过表达菌株的再生长速度快于野生株，而sRNA686的缺乏限制了D1菌株的再生长（图2B）。生长曲线结果表明，在4 mg/L PB压力下，过表达sRNA686的菌株生长速度略快于野生株，而D1和K13的sRNA686敲除株的生长受到显著限制（图2C）。同时，phoP基因敲除菌株几乎无法生长。这些结果表明，sRNA686有助于CRKP的PB-HR。因此，sRNA686在下文中被称为PB HR相关的sRNA（PB HR associated sRNA, PhaS）。
图1.RT-qPCR检测NP菌株及其HSP菌株中sRNA686的表达水平。
图2. sRNA686增强了CRKP中多黏菌素HR。（A）sRNA686过表达和缺陷菌株（K13、D1 和 MGH78578）中PB-HR的群体分析（PAP）。（B）用16 mg/L PB处理的EV、sRNA686+、ΔsRNA686和ΔphoP菌株的杀菌曲线。（C）EV、sRNA686+、ΔsRNA686和ΔphoP菌株在4 mg/L PB压力下的生长曲线。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。*，P < 0.05，**，P < 0.01，***，P < 0.001，ns，不显著。
然后，研究者通过绿色荧光蛋白报告基因证明PhaS直接靶向phoP，促进phoP和下游基因的表达（图3）。通过质谱分析发现PhaS是通过脂质A上L-Ara4N的修饰导致异质性耐药（图4）。
【参考文献】
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