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本文来源：中国美容整形外科杂志2023年10月第34卷第10期
DOI：10.3969/j.issn.1673-7040.2023.10.019
作者：白成祥 何明芬 蒋延凤
作者单位：成都市龙泉驿区第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科， 四川 成都 610100
通信作者：蒋延凤，
Email:13350067601@163.com
【摘要】A型肉毒毒素（botulinumtoxintypeA，BTX-A）注射已经作为临床治疗及美容领域的一线治疗手段，可以有效且安全地改善肌肉组织的兴奋性，提升患者生活质量。随着适应证拓展，不同种类BTX-A相继问世，其间的差异化也愈发受到重视。深入了解不同BTX-A间的差异对于临床药物转化、规范化治疗及降低医疗成本有重要意义。现对不同BTX-A间的差异化分别 从分子结构、生产过程、产品特征、效力、临床剂量转换、毒素弥散及免疫原性等方面的研究进展作一综述。
【关键词】A型肉毒毒素；差异化；临床应用
肉毒毒素（botulinum toxin，BTX）是一种由厌氧梭状芽胞杆菌产生的神经外毒素，可干扰神经末梢囊泡与胞膜融合，阻止神经递质的释放。目前，BTX分为A-H共8型，不同种类BTX干扰囊泡释放的靶点不同，但均会引起神经递质释放减少[1]。基于该特点，外周应用BTX能够有效抑制突触末梢 的乙酰胆碱释放，进而可逆性抑制肌肉收缩及腺体分泌 [2] 。
在不同种类BTX中，BTX-A及BTX-B已广泛用于临床及美容领域，而BTX-E也因其作用时间较短的特点逐渐在临床应用 [3] 。针对BTX-A，目前国际临床应用主要包括On abotulinumtoxin A （A/Ona）、Incobotulinumtoxin A （A/Inco）及 Abobotulinumtoxin A（A/Abo）3 种常见类型。而针对国内临床及美容领域的应用，主要包括A/Ona及国产的Lanbotulinum toxin A（A/Lan）两种类型。近年来，一些新型的 BTX-A，如 Chinbotulinumtoxin A（A/Chin）及 Daxibotulinumtoxin A（DAXI） 也相继问世，其效果持续时间可能较传统BTX-A更长 [4-5] 。不 同BTX-A产品由于其生产、制造及检测方式不同，其临床应用具有独一性，国际及国内相关专家共识也明确将不同 BTX-A 产品分别进行了适应证推荐。随着不同BTX-A产品的应用普及，明确了解不同产品从分子结构至临床应用的各方面差异有助于临床更有效地制定治疗策略及应对特殊情况。现就不同BTX-A相关的差异作一综述。
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通常，BTX-A 分子由神经毒素及神经毒素辅助蛋白 （neurotoxin-associated proteins, NAPs） 构成。神经毒素为 BTX-A 的活性成分，由相对分子量约为100kDa的重链及 50 kDa 的轻链构成。其中重链可以特异性识别及锚定突触前膜相关受体，帮助毒素分子以胞吞形式进入前膜。轻链则可在前膜内特异性剪切可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因 子结合蛋白受体复合物，阻止囊泡与突触前膜的融合及神经递质的释放 [6] 。NAPs 主要包括无毒非血凝素（non-toxic non-hemagglutinin, NTNHA）及血凝素（hemagglutinin, HA）。其 中，NTNHA 可提高 BTX-A 在自然界中的稳定性，帮助BTX-A 抵抗极端酸性环境及蛋白酶水解 [7] 。而HA则有助于 BTX-A 在小肠上皮中的转位，提高BTX-A的口服毒性 [8] 。
不同BTX-A产品均由肉毒杆菌Hall株生产，其神经毒素部分的结构相同。不同BTX-A产品的分子结构差异主要源于NAPs，其中A/Inco、A/Chin 及 DAXI 不包含 NAPs，仅含有神经毒素，总分子量约为150kDa [4-5] 。而A/Ona、A/Lan 及 A/Abo 含有不同分子量的NAPs（主要受HA影响），其总分子量分别约为900kDa、900 kDa 及400 kDa [9] 。NAPs 的差异对不同BTX-A的保存及临床应用影响甚微。在保存过程中，现有不含NAPs的A/Inco及DAXI均能够在室温进行保存，较含有NAPs的其他BTX-A产品的保存条件（2~8℃）更为宽泛。另外，A/Inco在同类产品中的保存时间最长（3年），同样提示NAPs对于BTX-A产品的保存稳定性影响不大。在临床应用中，BTX-A 的作用效果依赖于NAPs与神经毒素的解离。研究 [10] 报道，NAPs 在 pH<6.25 时，不会与神经毒素解离；而当pH>7.0 时，NAPs会迅速与神经毒素解离并释放出游离的神经毒素发挥作用。结合临床治疗中常采用生理盐水 （pH=7）对不同 BTX-A 产品进行稀释，在这种情况下， BTX-A 中的神经毒素可迅速与NAPs解离并发挥作用，提示 NAPs 对于不同BTX-A产品临床应用的疗效影响不大。另外，临床应用BTX-A过程中，机体会分别产生针对神经毒素的中和抗体与针对NAPs的非中和抗体。中和抗体的产生会直接影响BTX-A疗效，但针对NAPs的非中和抗体产生一般不会影响神经毒素的活性及效果 [11] 。其中研究 [12] 发现，在产生 NAPs 相关非中和抗体的小鼠中，应用BTX-A仍能产生肌肉麻痹的效果，提示非中和抗体对神经毒素的活性无影响。而另一项研究 [13] 发现，相比于A/Inco 与A/Ona，多次重复注射 A/Abo（NAPs 分子量中等，介于前两者之间）产生的中和抗体更高，提示NAPs与临床BTX-A中和抗体的产生无相关性。
不同BTX-A的生产流程不同，为各自独有，其生产流程 主要包括培养、分离、沉淀、纯化、特性检验、分装、干燥及包装等过程。生产流程的不同会引起BTX-A分子结构及产品特征差异。在生产过程中，A/Ona采用反复沉淀及再溶解法后进行真空干燥处理。A/Abo采用酸沉淀法后通过柱层析及冷冻干燥处理。A/Lan、DAXI与Abo类似，采用冷冻干燥处理。针对A/Inco，其生产过程包括一系列的色谱分析以去除NAPs 及减少非活性毒素成分留存 [14] 。为限制神经毒素分子聚 集及附着于玻璃瓶壁，生产中需为BTX-A添加赋形剂,对此， A/Ona、A/Abo 及 A/Inco 均采用人血清白蛋白作为赋形剂， A/Lan 则采用明胶，两种赋形剂抗原性均极低。另外，DAXI的 赋形剂为一种稳定肽RTP004，该稳定肽包含35个氨基酸， 在生理pH环境中带正电荷并与DAXI紧密结合，可与细胞 外带负电的结构结合，以帮助BTX-A与神经末梢结合，延长 起效时间及减少弥散 [5] 。常见的BTX-A产品特征差异见表1。
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BTX-A 的效力是其生物活性的体现，主要由神经毒素部 分决定。不同BTX-A产品均包含相同的神经毒素结构，其效 力的差异体现于神经毒素中活性神经毒素含量的差异。通常，BTX-A 的效力通过小鼠半数致死剂量（median lethal dose，LD50）测定，并采用生物单位U进行计量 。然而，小鼠 LD50 检测方法受到小鼠系、性别、年龄、药物配制、注射方法及评估时间等多方面影响，不同BTX-A产品的小鼠LD50检测条件未能统一，因此其效力不能简单比较。对此，有研究采用不同BTX-A产品的LD50检测方法相互测试其他产品。其中，当采用A/Ona的LD50方法对A/Inco 进行检测时，研究发现A/Inco 效力显著低于标注的100 U。随后，当采用 A/Inco 的 LD50 方法对A/Ona和A/Inco进行检测时，研究发 现两者的效力相当 [17] 。针对不同BTX-A产品中的神经毒素含量，研究 [19] [18] 发现同样标注100U的A/Ona、A/Abo及A/Inco 中神经毒素的质量分别为0.73ng、0.65ng及0.44ng。在另一项研究中，100 U 的A/Ona、A/Abo 及 A/Inco 中神经毒素质量分别为0.9ng、0.538 ng 及0.4 ng。但三者效果相关轻链活性无差异，提示A/Inco中的活性神经毒素比例可能更高。而针对DAXI及国产的A/Lan，研究 [20-21] 发现每100U分别含神经毒素0.45ng及0.83ng。
除LD50方法外，现研究还采用小鼠足趾外展评分、肌力 测试及膈肌实验等方法评估不同BTX-A产品的效力，结果差异较大，同样提示，不同BTX-A效力不能简单转化。其中， 一项研究 [9] 采用了两项体外（轻链高效液相色谱及细胞相关 效力检测）及两项体内方法（复合肌肉动作电位及足趾外展 评分）检测了不同BTX-A的效力。结果发现，A/Ona较A/Inco 效果持续时间更长，提示其效力更高。然而，当采用体外膈肌实验检测时，研究 [22-23] 结果显示A/Inco较A/Ona 对膈肌的麻痹时间更长，而A/Ona与A/Lan对膈肌的麻痹时间相当，与上述结果有一定出入。另外，当采用大鼠腓肠肌肌力测试不同BTX-A 的效力时，研究 [4] 发现A/Chin 较 A/Ona、A/Lan 及A/Inco 麻痹达峰时间更短，持续作用时间更长，而A/Lan的效 果与A/Ona及A/Inco相当。
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虽然不同BTX-A的效力不能简单转化，但随着临床使用愈发广泛，临床中形成了不同BTX-A间的剂量转换比。不同BTX-A间的等效剂量换算比可以有效帮助患者进行药品切换，降低医疗成本等。由于A/Ona是应用最早且最广泛的 BTX-A 产品，大多剂量转换比较研究都将A/Ona作为对比参考 [24] 。
针对A/Inco 与A/Ona，现研究 [15] [26] [25] 报道其有效剂量换算比约为1：1，与临床前的效力比较研究结果相符。其中，单剂量 的A/Inco 和 A/Ona 治疗肌张力障碍（眼睑痉挛、颈部肌张力障碍）及眉间纹等疾病，其结果均提示等剂量的A/Inco与 A/Ona 疗效及安全性相当。针对A/Lan与A/Ona的一项研究总结了A/Lan在美容和治疗适应症中的疗效及安全性，结果显示，当A/Lan与A/Ona剂量换算比为1：1时，A/Lan与 A/Ona 的起效时间、效果持续时间及不良反应的发生差异均无统计学意义。
由于A/Abo的常规产品规格（500U/瓶）与其他BTX-A （100 U/ 瓶）差异较大，目前针对A/Abo与A/Ona的剂量换算存在一定争议，现有研究报道其换算比最低为1：1，最高为 11：1。A/Abo 与 A/Ona 剂量换算比差异巨大源于真实临床应用中对A/Abo的使用差异，其受到患者疾病状态、注射肌肉数目及剂量等诸多因素影响。对此，在肌张力障碍患者中（包括眼睑痉挛、痉挛性构音障碍及颈部肌张力障碍），研究发现 A/Abo 与 A/Ona 的等效剂量比≤3：1。而当等效剂量比>3：1 时，其不良反应发生显著提高 [27] 。另外，就成人上肢痉挛状态， 美国食品药品监督局对A/Abo及A/Ona的推荐最大治疗剂 量分别为1000U及400U，同样提示其剂量等效比≤3：1。
针对DAXI，由于其在生产中加入了独有的RTP004作为赋形剂，其临床疗效得到了巨大提升 [28] 。通常BTX-A的疗 效与产品中神经毒素的含量相关，但由于RTP004的加入， DAXI 与其他BTX-A不能简单进行剂量换算。在重度眉间纹 的治疗中，研究发现虽然40U的DAXI与20U的A/Ona在 神经毒素含量上相同（均为0.18ng），但DAXI临床疗效及效 果持续时间均较A/Ona更高 [29] 。另外，在颈部肌张力障碍的 治疗中，研究显示当DAXI的平均剂量为125U时，患者的平 均症状缓解时间为24周 [5] 。而在相似患者群体中进行A/Ona 治疗时，结果发现，当A/Ona平均剂量为205U时，患者的平 均症状缓解时间为14周，也提示DAXI的疗效更好。
出于伦理学考虑，临床研究无法得到BTX-A在每一种疾病中完整的剂量效应曲线，因此不能全面反映其疗效差异。大多数研究比较了单剂量不同产品在不同疾病中的疗效及安全性。然而，剂量的选择会影响试验结果。当比较的剂量选择过低，患者疗效不佳，无法说明两者的优劣。而当剂量选择过高时则易出现天花板效应，无法真实反映不同产品在临床中的疗效。除剂量外，不同产品疗效差异还与研究设计、随访评估时间及评估量表的敏感性等因素相关。因此，临床医师及研究人员需谨慎理解不同BTX-A剂量比较研究的意义。
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毒素弥散是指在注射部位远隔区域出现了毒素的效果。毒素弥散至周围区域可能导致不良反应发生，如颈部和颅面 部的毒素弥散可能会导致吞咽困难、发音困难及复视的发 生。药物的弥散与分子量大小有一定关系，通常高分子量的 复合物较低分子量弥散更慢。然而，BTX-A由于稀释及溶液 配制的原因，其复合物中的神经毒素部分会与NAPs迅速分离，并不会导致不同BTX-A产品弥散出现差异。在临床应用 过程中，BTX-A的弥散度与注射剂量、稀释浓度、注射技术、 靶点性状及注射后处理等诸多因素有关，因此不同情况下的 BTX-A 弥散度不能简单比较。现有临床研究多采用BTX-A 注射后的无汗区域面积评估其弥散情况，其中，在保证各种 条件相似情况下，剂量换算比为1：1的A/Inco与A/Ona弥散 [28] 度相当，剂量换算比为2.5：1.0的A/Abo与A/Ona弥散度相 当 。针对A/Lan 与A/Ona，研究 [30] 表明，剂量换算比为1：1 时，两者弥散度具有一定争议。而针对DAXI，研究表明其与 A/Ona 的等效弥散剂量比为2.5：1.0 [5] 。
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在临床应用过程中，BTX-A的免疫原性会导致机体产生 相应的抗体。其中，针对神经毒素部分的中和抗体生成是继发性无应答的重要原因。BTX-A产品中活性与非活性神经 毒素的比例会影响其免疫原性，受到生产过程等因素影响。其中非活性神经毒素拥有与活性神经毒素相同的抗原表位， 其比例的提高可导致神经毒素生物活性相对降低，免疫原性 相对增高 [31] 。以A/Ona为例，最初的A/Ona中非活性蛋白的 [11] 含量高达90%，100U的A/Ona中含有25ng的神经毒素。经 过改良后，后续100U的A/Ona中包含5ng神经毒素，其抗 体生成率约为前者的1/6。针对不同BTX-A的免疫原性，临 床应用中常采用重复注射相关中和抗体产生率进行评估。研 究 发现，A/Ona 的中和抗体生成率为0.2%~3.6%，A/Inco为 0～0.5%。当 A/Abo与A/Ona 剂量换算比为2.5：1.0时，其中 和抗体生成率为0.9%~3.6%。然而，由于不同研究纳入患者 的人种、适应证、研究设计、注射方法及中和抗体检测的方式 不同，不同BTX-A的免疫原性对比需谨慎。实际临床应用 中，BTX-A需重复注射，累积注射剂量、时长、次数，单次注射 剂量及重复注射间隔时间等均会影响其免疫原性。因此，选 择最低有效注射剂量，保证最长可接受的注射周期，以避免 非必要更换注射品牌可有效降低中和抗体的生成，降低继发 性无应答的发生 [32] 。
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目前，BTX-A注射已经作为临床治疗及美容领域的一线 治疗手段，可以有效且安全地改善肌肉的高兴奋状态，提高 患者生活质量。随着应用愈发广泛，不同BTX-A相继问世， 其最大的差异源于其生产过程、分子结构及效力。因此，不同 BTX-A 不能简单相互转换，而临床中对于不同BTX-A间的 等效剂量换算尤为重要。在临床治疗过程中，除不同BTX-A 差异外，患者疾病状态、注射技术及注射后处理均会对疗效 及安全性产生巨大影响，所以治疗前明确疾病诊断、精细化 异常运动模式分析，治疗过程中选取合适的BTX-A，规范化 操作，治疗后定期随访及不良事件报告需要格外引起重视。
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