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背景多囊卵巢综合征（PCOS）是最常见的妇科内分泌疾病。目的：本研究评估了茴香（Pimpinella anisum L.，简称P. anisum）果实对多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型中促炎细胞因子、氧化应激标志物及卵巢组织结构的治疗效果。方法：诱导产生PCOS后，将雌性Wistar大鼠随机分为对照组和PCOS组。各组大鼠每日口服正常盐水或茴香的水醇提取物（剂量分别为200和400 mg/kg），持续21天。治疗结束后，收集卵巢和肝脏组织，测定脂质过氧化水平、抗氧化状态、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的信使核糖核酸（mRNA）表达量及其含量。此外，还对卵巢组织进行了组织病理学检查。结果我们的研究发现，生化参数和组织病理学参数均呈现剂量依赖性变化。茴香治疗显著降低了卵巢和肝脏组织中TNF-α和IL-6的mRNA表达水平及其含量。同时，它还降低了丙二醛（MDA）水平，提高了PCOS大鼠卵巢和肝脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性。此外，PCOS大鼠模型中的卵泡囊肿数量也显著减少。结论：茴香对PCOS大鼠的有益作用部分归因于其对卵巢组织中炎症和氧化应激标志物的抑制作用。这些发现表明，茴香可能是治疗PCOS相关疾病的一个潜在候选药物。多囊卵巢综合征（PCOS）是一种影响育龄妇女的复杂内分泌疾病，全球约有5%至10%的妇女受其影响（1, 2）。其临床特征包括月经不规律、高雄激素血症（如多毛和痤疮）、肥胖以及慢性稀发排卵或无排卵（3, 4）。研究表明，在生育年龄患有PCOS的女性中，约有15%面临包括代谢、生殖和内分泌系统紊乱在内的多种健康问题的高风险（5, 6）。尽管进行了大量研究，但PCOS的病理生理机制仍不完全清楚。PCOS是一种多因素疾病，涉及腹部肥胖（7）、激素紊乱（8）、胰岛素抵抗（9）以及表观遗传和环境因素的相互作用（10）。氧化应激是指氧化剂与抗氧化剂之间的平衡被破坏，导致细胞水平上过量自由基（ROS）的形成，这会破坏卵巢卵泡的发育，损害卵巢组织，引起DNA损伤和细胞凋亡（11, 12）。PCOS患者常出现血清脂质过氧化物水平升高、炎症标志物（13-15）升高以及外周组织巨噬细胞浸润，从而导致组织损伤和功能受损。这些参数被认为是包括PCOS在内的生殖疾病的潜在诱因（16, 17）。了解与PCOS相关的炎症和氧化能力之间的相互作用对于识别和管理这种卵巢疾病至关重要。近年来，众多研究探索了多酚在治疗生殖障碍方面的潜在益处（18, 19）。茴香（Pimpinella anisum L.，简称P. anisum），俗称茴香籽或茴香，是伞形科（Apiaceae）的一种芳香植物，主要分布于中东、小亚细亚和印度（20, 21）。茴香籽提取物含有多种化合物，包括1.5%至6%的精油（主要为反式茴香脑）、8%至11%的脂肪酸（如棕榈酸和油酸）、4%的碳水化合物和18%的蛋白质，以及大量的酚类化合物，如黄酮类化合物和酚酸（22）。多项研究已经强调了茴香果实的药理特性，包括抗炎、抗氧化、保肝、缓解痛经、降脂和抗糖尿病活性。近期研究表明，茴香具有雌激素样作用，可促进卵巢卵泡的发育，恢复卵巢结构，减少更年期潮热，并改变黄体生成素（LH）的水平（23-26）。尽管早期研究已报道了茴香在PCOS中的疗效，但这些研究主要集中在其对与PCOS相关的激素和生化因子的影响上。鉴于目前缺乏关于茴香籽提取物对PCOS组织中炎症和氧化应激因子影响的研究，本研究旨在探讨茴香果实水醇提取物对大鼠PCOS模型中炎症和氧化应激标志物以及卵巢组织结构的影响。本实验使用了20只雌性Wistar大鼠（8-10周龄），体重为200 ± 20 g，购自伊朗巴斯德研究所中央动物房（伊朗德黑兰）。动物被群体饲养（2只/笼）在温度控制为22 ± 2°C的房间内，保持12:12小时的光照/黑暗周期，并在实验前至少进行1周的当地环境适应。提供标准颗粒饲料（Pars公司，伊朗德黑兰）和自来水供其自由摄取。所有实验程序均按照美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针进行，并获得了阿尔达比勒医科大学伦理委员会的批准（伦理代码：IR.ARUMS.REC.1400.183）。茴香的果实购自塔布里兹的当地草药市场。经塔布里兹医科大学药学院生药学系植物标本室鉴定并确认植物材料后（标本号：tbz-fps-45），将果实干燥并使用搅拌机粉碎。随后，将粉碎的植物材料用3升70%乙醇浸泡三次，每次浸泡48小时。最后，过滤得到的提取物，并在40°C下使用旋转蒸发器真空蒸发溶剂，直至完全干燥。按照Sofowora（27）和Trease与Evans（28）指定的标准实践，对茴香提取物进行了多项定性和定量植物化学分析。使用2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）评估茴香果实提取物的自由基清除活性。首先制备茴香提取物的储备液（1 mg/mL），然后使用系列稀释法制备不同浓度的提取物溶液。将等体积的茴香提取物溶液加入到浓度为0.08%的DPPH溶液中（29, 30）。孵育30分钟后，在517 nm处测量所有溶液以及空白样本的吸光度。最后，使用以下公式计算茴香提取物的DPPH自由基清除活性百分比：R (%) = 100 × [(吸光度空白 - 吸光度样本) / 吸光度空白]此外，从还原百分比（R%）与茴香提取物浓度的关系图中确定了使DPPH自由基减少50%所需的提取物浓度，即RC50。采用Folin-Ciocalteu法测定100克干燥茴香果实材料中的总酚含量。首先，将500微升茴香提取物原液（1 mg/mL）与5毫升Folin-Ciocalteu试剂（10%，v/v）和4毫升1 M碳酸氢钠溶液混合（31）。在25ºC下孵育15分钟后，于765 nm处测定形成的蓝色溶液的紫外吸光度。以没食子酸作为标准酚类化合物，并对其溶液重复相同的过程。根据绘制的没食子酸校准曲线计算茴香果实提取物中的总酚含量。为确认100克干燥茴香果实材料中的总黄酮含量，将500微升茴香提取物原液（1 mg/mL）与1.5毫升甲醇、2.8毫升蒸馏水、0.1毫升氯化铝（10%）和0.1毫升醋酸钾混合。孵育30分钟后，于435 nm处测定形成的黄色溶液的紫外吸光度（29）。以槲皮素作为标准酚类化合物，并对其溶液重复相同的过程。根据绘制的槲皮素校准曲线计算茴香果实提取物中的总黄酮含量。根据Brawer等人的方法（32），并稍作修改（使用2 mg/kg溶于0.2 mL芝麻油的雌二醇戊酸酯（EV），由伊朗Aburaihan制药公司生产），通过在动情期单次肌肉注射EV来实验性诱导PCOS大鼠模型。EV注射后60天，进行阴道涂片检查，以确定动情周期的异常情况和持续性阴道角化上皮细胞（PVC）的存在，这是卵巢囊肿的症状之一。将雌性Wistar大鼠随机分为四组（n = 5/组），包括：（1）对照组：未诱导PCOS的大鼠，给予自来水和食物；（2）PCOS组：PCOS大鼠，每天口服（灌胃）0.5 mL生理盐水，持续3周；（3）多囊卵巢综合征+茴香 200 mg/kg组（PCOS + PA200）：PCOS大鼠，每天口服一次茴香提取物，剂量为200 mg/kg，持续3周；（4）多囊卵巢综合征+茴香 400 mg/kg组（PCOS + PA400）：PCOS大鼠，每天口服一次茴香提取物，剂量为400 mg/kg，持续3周（26）。图1展示了实验设计。![]()
在给予茴香 21天后，所有动物均通过腹腔（IP）注射酮胺/甲苯噻嗪（80/10 mg/kg）进行麻醉，并通过颈椎脱臼法处死。分离大鼠的肝脏和卵巢并进行称重。将右侧卵巢和肝脏在裂解缓冲液中匀浆，于4°C下以1250 × g离心30分钟（33），收集上清液并保存在-80°C直至分析。左侧卵巢用10%甲醛溶液固定，以备进行组织病理学检查。3.8. 卵巢和肝脏组织中TNF-α和IL-6水平的测定使用大鼠ELISA试剂盒（DuoSet，R&D Systems，中国）测定组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的水平。测定按照制造商的说明进行。3.9. 卵巢和肝脏组织中MDA水平以及SOD和GPx活性的测定使用商业比色试剂盒（ZellBio GmbH，乌尔姆，德国）按照制造商的协议测定匀浆上清液中的丙二醛（MDA）含量。为测定组织匀浆上清液中的超氧化物歧化酶（SOD）活性，使用Ransod试剂盒（Randox Labs，克拉姆林，英国）并按照制造商的说明进行操作，活性以U/mg蛋白表示。使用GPx测定试剂盒（ZellBio GmbH，乌尔姆，德国）测定组织匀浆中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性，结果以U/mg表示。测定卵巢和肝脏组织中TNF-α和IL-6基因的相对表达量，以GAPDH基因为参考基因。使用Trizol One Step RNA Reagent（Cat. No. BS410A，Bio Basic，加拿大）从组织样品中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific TM NanoDrop 2000，美国）评估提取RNA的质量。使用cDNA合成试剂盒（YTA，伊朗）和T100TM Bio-Rad 96孔热循环仪进行cDNA的合成。实时PCR使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix（YTA，伊朗）和Real-Time PCR Step One Plus（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，美国）进行。引物序列见表1。实时PCR程序包括95°C预孵育10分钟，随后进行40个循环：95°C 15秒，60°C 30秒，72°C 25秒。qRT-PCR结果采用2-ΔΔCt法进行分析。![]()
表1. 用于定量实时PCR（qRT-PCR）的引物序列列表。卵巢样本被取出后，置于4°C的10%甲醛溶液中浸泡24小时，之后经过一系列梯度乙醇脱水处理，并嵌入石蜡块中。然后，使用切片机制备5微米厚的纵切面切片，最终用苏木精和伊红（Merck，德国）染色，以便使用配备数码相机的光学显微镜（34）观察每组卵巢中每个切面的囊肿数量。所有数据均使用GraphPad Prism软件8.0版进行分析，并以平均值±标准误（SEM）的形式表示。对炎性标志物、氧化应激标志物、组织病理学检查结果以及分子水平的结果进行单因素方差分析（ANOVA），随后采用Tukey事后检验来评估实验组之间的比较。P值<0.05认为具有统计学意义。定性试验显示，茴香的甲醇提取物中存在多种化合物，包括生物碱、黄酮类、皂苷和鞣质。此外，茴香果实提取物中未发现强心苷和香豆素。体外自由基清除试验结果表明，与标准品槲皮素相比，茴香果实提取物表现出令人满意的抗氧化活性。以槲皮素（3.7 µg/mL）作为阳性对照，提取物对DPPH的抗氧化活性RC50值为304.5 µg/mL。此外，每100克干燥茴香果实中总酚和黄酮类化合物的含量分别计算为5.1克没食子酸当量和3.4克槲皮素当量。因此，DPPH自由基清除活性的结果与总酚和黄酮类化合物含量的数据一致，表明茴香果实中高含量的酚类化合物部分贡献了观察到的体外抗氧化活性。4.2. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠卵巢组织中炎性细胞因子的影响如图2A所示，与对照组相比，多囊卵巢综合征（PCOS）组卵巢中TNF-α水平显著升高（P < 0.001）。此外，在给予400 mg/kg 茴香治疗的组中，与PCOS组相比，卵巢TNF-α水平显著降低（图2A，P < 0.05）。PCOS组卵巢中IL-6水平也显著高于对照组（图2B，P < 0.001）。然而，在给予200和400 mg/kg 茴香的组中，与PCOS组相比，IL-6水平有所下降，但未达到显著性水平。图2. 茴香提取物（200和400 mg/kg，口服，每日一次，持续3周）对多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠卵巢（A和B）和肝脏（C和D）组织中TNF-α和IL-6水平的影响。数值表示为平均值±标准误（SEM）（每组n=5）。数据采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。*** P < 0.001与对照组比较，# P < 0.05，### P < 0.001与PCOS组比较。PCOS：多囊卵巢综合征组；PA：Pimpinella anisum（藏茴香）。4.3. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠肝脏组织中炎性细胞因子的影响根据图2C和D，与对照组相比，多囊卵巢综合征（PCOS）组肝脏中TNF-α和IL-6的水平显著升高（P < 0.001）。此外，与PCOS组相比，给予200和400 mg/kg剂量的茴香治疗后，肝脏中TNF-α和IL-6的水平均显著降低（图2C和D，P < 0.001）。4.4. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠卵巢组织中氧化应激生物标志物的影响与对照组大鼠相比，PCOS组卵巢中丙二醛（MDA）水平显著增加（图3A，P < 0.001）。此外，在给予200和400 mg/kg 茴香的大鼠中，与PCOS组相比，MDA水平有所降低，且仅在400 mg/kg剂量组中观察到显著性差异（图3A，P < 0.05）。图3. 茴香提取物（200和400 mg/kg，口服，每日一次，持续3周）对多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠卵巢组织中丙二醛（MDA）（A）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（B）和超氧化物歧化酶（SOD）（C）活性的影响。数值表示为平均值±标准误（SEM）（每组n=5）。数据采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。* P < 0.05，*** P < 0.001与对照组比较，# P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001与PCOS组比较。PCOS：多囊卵巢综合征组；PA：Pimpinella anisum（藏茴香）。与对照组相比，多囊卵巢综合征（PCOS）组卵巢中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性降低，但差异不显著。然而，与PCOS组相比，给予200和400 mg/kg剂量的茴香治疗后，大鼠卵巢中的GPx活性显著增加（图3B，分别为P < 0.01和P < 0.001）。如图3C所示，与对照组相比，PCOS组卵巢中的超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低（图3C，P < 0.05）。然而，与PCOS组相比，给予200和400 mg/kg 茴香的大鼠卵巢中的SOD活性显著增加（图3C，P < 0.001）。4.5. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠肝脏组织中氧化应激生物标志物的影响在诱导产生多囊卵巢综合征后，肝脏中的丙二醛（MDA）水平显著高于对照组（图4A，P < 0.001）。给予400 mg/kg剂量的茴香后，与PCOS组相比，肝脏中的MDA水平降低（图4A，P < 0.001）。图4. 茴香提取物（200和400 mg/kg，口服，每日一次，持续3周）对多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠肝脏组织中丙二醛（MDA）（A）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（B）和超氧化物歧化酶（SOD）（C）活性的影响。数值表示为平均值±标准误（SEM）（每组n=5）。数据采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。*** P < 0.001与对照组比较，### P < 0.001与PCOS组比较。PCOS：多囊卵巢综合征组；PA：Pimpinella anisum（藏茴香）。与对照组相比，多囊卵巢综合征（PCOS）组肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性显著降低（图4B，P < 0.001）。给予400 mg/kg剂量的茴香后，与PCOS组相比，肝脏中的GPx活性显著增加（图4B，P < 0.001）。在PCOS组中，与对照组相比，肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低（图4C，P < 0.001）。然而，给予茴香治疗后，与PCOS组相比，肝脏中的SOD活性有所增加，且400 mg/kg剂量的效果优于200 mg/kg剂量（图4C，P < 0.001）。4.6. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠卵巢组织中TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响我们的研究结果显示，与对照组相比，给予200和400 mg/kg 茴香的PCOS大鼠卵巢中TNF-α mRNA表达水平显著降低（图5A，P < 0.001）。此外，茴香治疗还降低了IL-6细胞因子的表达。然而，与对照组相比，给予400 mg/kg 茴香的PCOS大鼠显示出显著性差异（图5B，P < 0.001）。图5. 茴香提取物（200和400 mg/kg，口服，每日一次，持续3周）对多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠卵巢（A和B）和肝脏（C和D）组织中TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响。数值表示为平均值±标准误（SEM）（每组n=3）。数据采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。### P < 0.001与PCOS组比较。PCOS：多囊卵巢综合征组；PA：Pimpinella anisum（藏茴香）。4.7. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠肝脏组织中TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响关于细胞因子表达，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析显示，与PCOS组相比，给予200和400 mg/kg 茴香治疗的PCOS大鼠肝脏中TNF-α和IL-6的mRNA表达水平显著降低（图5C和D，P < 0.001）。4.8. 茴香提取物对多囊卵巢综合征诱导大鼠卵泡生成的影响对照组大鼠的卵巢显示正常结构，无任何病理变化。然而，PCOS大鼠的组织病理学结果显示存在许多大小不等的囊性卵泡。有趣的是，与PCOS组相比，PCOS + PA 400 mg/kg组大鼠卵巢中的卵泡囊肿数量显著减少（图6A和B，P < 0.05）。图6. 茴香提取物（200和400 mg/kg，口服，每日一次，持续3周）对多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠卵泡数量（A）和卵巢组织病理学（B）的影响（H&E染色，×100）。数值表示为平均值±标准误（SEM）（每组n=3）。数据采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。# P < 0.05与PCOS组比较。PCOS：多囊卵巢综合征组；PA：Pimpinella anisum（藏茴香）。本研究结果表明，茴香能够以剂量依赖性的方式改善多囊卵巢综合征（PCOS）诱导大鼠的卵巢功能，这与氧化应激标志物和促炎细胞因子（包括TNF-α和IL-6的mRNA表达水平及其在卵巢和肝脏组织中的含量）的减少有关。此外，茴香还减少了卵巢卵泡囊肿的数量。PCOS患者存在内分泌代谢障碍、雄激素水平异常和慢性炎症（8）。虽然大多数研究都集中在高雄激素血症对PCOS病理机制（特别是卵泡发育不良和无排卵）的影响上，但炎症作为PCOS病理生理学中的主要贡献因素之一，是一个关键的风险因素（35, 36）。多项研究表明，PCOS与卵巢卵泡的进行性炎症和卵巢功能下降有关（13, 37）。据报道，IL-6和TNF-α是炎症反应的重要介质，与卵巢卵泡的凋亡或坏死有关（38）。我们关于PCOS的实验数据还显示，以显著活性氧（ROS）形成和抗氧化剂降解为特征的氧化应激在PCOS发病中起着关键作用。氧化应激状态与炎症反应之间的关联已在临床前动物模型和PCOS女性中得到了证实（39, 40）。此外，新兴报告表明，草药和替代治疗对PCOS症状有积极影响，特别是在减轻炎症和氧化应激方面（41, 42）。在此背景下，我们评估了茴香作为保护剂在PCOS大鼠模型中对这些标志物的影响。许多研究表明，由于茴香中含有负责其药用特性的植物化学物质（如黄酮类化合物和反式茴香脑），因此它具有作为抗氧化剂和抗炎因子的巨大潜力（43-45）。在本研究中，给予茴香的PCOS大鼠表现出TNF-α和IL-6 mRNA表达降低，同时卵巢组织中这些参数的含量也减少。此外，PCOS大鼠的卵巢丙二醛（MDA）水平增加，而超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低。据我们所知，目前尚无已发表的研究探讨茴香给药对PCOS大鼠卵巢组织中炎症反应和氧化应激生物标志物的影响。与我们的结果一致的是，在其他器官中，给予茴香后也报告了炎症减轻和氧化/抗氧化状态恢复，这些研究是在大鼠的各种疾病模型中进行的（46-49）。此外，多项研究表明，茴香及其生物活性化合物可以在细胞水平上影响基因表达。Dargahi等（50）和Iannarelli等（51）报道，给予茴香种子水提取物（0.16 mg/kg/天，通过口服灌胃10天）和茴香籽精油（与0.3%茴香籽一起孵育）可降低卵清蛋白诱导的哮喘小鼠和肺细胞系中促炎细胞因子的mRNA表达，并抑制炎症反应。其他研究通过抑制体外和体内条件下IL-6、TNF-α和核因子κB（NF-κB）等炎症途径的基因表达和释放，证实了茴香的主要化合物反式茴香脑（52-54）和黄酮类化合物（55, 56）的抗炎活性。此外，PCOS大鼠中抗氧化活性和脂质过氧化的剂量依赖性变化可能归因于该提取物对氧化遗传机制的影响（52）。如前所述，慢性炎症、氧化应激和mRNA表达改变是PCOS的常见特征（57）。鉴于炎症与氧化应激之间的密切联系，升高的氧化应激通常参与炎症的发展（40）。此外，“天然产物对PCOS的影响：从传统医学到现代药物发现”（58）一文中描述了天然来源对PCOS的肝保护作用。在我们的研究中，茴香在实验性PCOS模型大鼠中表现出肝保护作用，显著减少了氧化应激和炎症对肝脏的损害，这可能是由于其改善肝功能的能力（48）。本研究数据显示，茴香减少了PCOS大鼠的卵泡囊肿数量，这可能有助于改变炎症标志物的基因表达，并降低卵巢组织中炎症和氧化应激标志物的含量。值得注意的是，400 mg/kg剂量的茴香治疗比200 mg/kg剂量更有效。这些发现共同表明，较高浓度的提取物可能含有更高水平的生物活性成分。换言之，茴香可考虑作为PCOS的有效治疗选择。综上所述，我们的研究结果表明，以剂量依赖性的方式给予茴香可抑制PCOS相关的TNF-α和IL-6以及MDA的产生，并恢复PCOS大鼠的SOD和GPX活性。这些发现支持将茴香作为抑制PCOS的辅助治疗手段。
