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肥胖因其发病率激增及多种并发症已成为全球性的公共负担，而白色脂肪组织（WAT）的棕色化被认为是对抗肥胖的一种有希望的策略。柑橘属植物酸柚（Citrus aurantium L. var. amara Engl.，简称CAVA）的花（代代花）是一种常用的民间药物和膳食补充剂，用于缓解消化不良，并已收录于《中国药典》。我们之前的研究表明，代代花具有抗肥胖潜力，但其在白色脂肪组织棕色化中的作用尚不清楚。本研究旨在表征代代花中黄酮类化合物的成分，并阐明其抗肥胖能力，特别是对白色脂肪组织棕色化的影响。采用AB-8大孔树脂从代代花中获得梯度乙醇洗脱液。通过3T3-L1细胞和胰腺脂肪酶抑制剂测定来评估潜在的抗肥胖体外效果。使用高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱-质谱（UPLC/MS）测定来表征不同洗脱液的化学特征。运用网络药理学和分子对接测定来揭示潜在的抗肥胖靶点。此外，构建高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型，以探索体内抗肥胖作用及其机制。将具有高黄酮含量且对3T3-L1前脂肪细胞增殖和胰腺脂肪酶活性具有较强抑制作用的30%乙醇洗脱液视为代代花黄酮提取物（CAVAF）。在CAVAF中鉴定出19种化合物。网络药理学分析表明，AMP活化蛋白激酶（AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是CAVAF缓解肥胖的潜在靶点。动物研究表明，CAVAF干预显著降低了高脂饮食喂养的肥胖小鼠的体重、白色脂肪组织重量、血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。CAVAF治疗还显著减轻了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗以及白色脂肪组织和棕色脂肪组织的形态变化。CAVAF补充通过调节小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的mRNA表达，有效抑制了iWAT的炎症。此外，CAVAF给药显著上调了小鼠iWAT中产热标志物（包括细胞色素C、ATP合成酶、Cidea、Cox8b，尤其是解耦联蛋白1（UCP1））的基因表达水平。CAVAF干预还显著增加了小鼠iWAT中PRDM16、PGC-1α、SIRT1、AMPK-α1、PPARα和PPARγ的mRNA表达水平。CAVAF治疗显著促进了高脂饮食喂养小鼠的白色脂肪组织棕色化。这些结果表明，代代花中的黄酮类提取物可能是治疗肥胖的有希望候选药物。肥胖是一种以持续性低度炎症为特征的慢性疾病，通常伴随糖尿病、高血压、高脂血症和非酒精性脂肪肝等多种并发症（de A. Boleti等，2023；Hotamisligil，2006）。肥胖已成为全球性的公共卫生问题。然而，目前可用的抗肥胖药物疗效有限，且存在腹泻、心血管疾病甚至死亡等不良反应。因此，寻找有效且安全的减肥治疗方法越来越受到关注（Borah等，2021）。生物体的脂肪组织可分为两大类：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）（Giralt和Villarroya，2013）。由于WAT和BAT在组织形态学和细胞密度等方面存在许多差异，它们在能量代谢中发挥着相反的作用（Ziqubu等，2023）。BAT的脂肪细胞比WAT的脂肪细胞含有更小的脂滴和更丰富的线粒体。BAT在能量消耗和非战栗性产热方面表现出更好的能力，可促进WAT的脂肪分解。此外，BAT具有丰富的神经支配和血管化，以实现高效的热量传递（Wang和Seale，2016）。然而，成年人体内BAT的数量很少，因此其功能非常有限。近年来，WAT的棕色化已被认为是一种治疗肥胖相关疾病的新颖治疗视角（Altinova，2022）。WAT的棕色化是指白色脂肪细胞发生表型变化，获得间充质特征，并转化为棕色样脂肪细胞（也称为米色脂肪细胞）的复杂细胞过程。米色脂肪组织是一种同时具有WAT和BAT特征的脂肪组织。重要的是，由于线粒体数量增加和氧化磷酸化加速，米色脂肪组织具有巨大的产热潜力（Sakers等，2022）。大量研究表明，棕色样脂肪细胞的形成是可逆的，且WAT的棕色化可由外部刺激（如寒冷和药物）触发（Yan等，2023）。支持这一观点的是，我们之前的研究表明，许多天然产物通过诱导WAT的棕色化来发挥抗肥胖作用（Ma等，2022）。柑橘属植物（Citrus aurantium L. var. amara Engl.，简称CAVA）的花属于芸香科柑橘属，是一种具有抗炎和抗氧化等多种药理作用的生物药理物种。在中医中，CAVA长期被视为一种经典的消化药物（中华人民共和国国家中医药管理局，1999）。根据中医理论，大多数消化药物具有健脾降脂的能力，有助于减少脂质积累。例如，山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）是一种经典的消化药物，其主要成分金丝桃苷已被证明在抗肥胖中发挥着重要作用（Cheng等，2023）。已有研究表明，未成熟柑橘（Citrus aurantium L.或其栽培品种）的干燥果实（即枳壳）具有抗脂肪生成和抗炎等多种药理作用（Gao等，2021）。先前的研究表明，CAVA的花具有显著的降脂和减重效果（Li等，2021；Shen等，2019）。柑橘类黄酮被报道具有多种有益作用。然而，代代花总黄酮提取物（CAVAF）对WAT棕色化的影响尚不清楚。因此，本研究旨在探讨CAVAF对WAT棕色化的影响，并探索其潜在的作用机制。干燥的代代花购自中国安徽省亳州卓然花茶贸易有限公司，并经南方医科大学中医药学院沈春燕教授鉴定。标本（编号：20200930DDH12）保存于南方医科大学中医药学院。简而言之，将200克干燥的代代花粉末用80%乙醇（1:10，v/v）在回流管理下提取3小时。在室温下以4000转/分钟的速度离心10分钟后，收集上清液。此过程重复3次。将上清液混合，并在45°C下用旋转蒸发器减压蒸发。在45°C的烘箱中干燥48小时后，将80%乙醇提取物用蒸馏水溶解，并随后通过AB-8大孔树脂进行柱色谱分离。依次用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和90%乙醇洗脱80%乙醇提取物。将30%、50%和70%乙醇洗脱液溶解并过滤，以进行后续的UPLC/MS分析。使用Hypersil Gold色谱柱（100 × 2.1 mm，1.9 μm），注射体积为2 μL，流速为0.3 mL/min进行分析。流动相由0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）组成。梯度洗脱条件为：0–3分钟，5–30% B；3–6分钟，30% B；6–8分钟，30–95% B；8–12分钟，95% B。使用Orbitrap Fusion质谱仪进行CAVAF的MS检测，配备ESI离子源，扫描范围为100至1000 m/z。其他参数如下：电子喷雾电离（+）和电子喷雾电离（−）的喷雾电压分别为3.50 kV和−2.50 kV；离子传输管温度为320°C；蒸发器温度为350°C；鞘气为40 Arb；辅助气为10 Arb。此外，基于Δ[ppm]小于5，确定化合物的分子式。通过Software Xcalibur 4.1分析离子片段，并参考PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和已发表的文献（Yu等，2020）来鉴定化合物。以柚皮苷、新柚皮苷和柚皮素为标准品，通过HPLC法测定30%、50%和70%乙醇洗脱液中的总黄酮含量。使用YMC C18色谱柱（250 × 6.6 mm，5 μm），注射体积为20 μL，流速为1 mL/min进行HPLC分析。流动相由0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）组成。梯度洗脱条件为：0–25分钟，15–20% B；25–35分钟，20% B；35–45分钟，20–30% B。采用台盼蓝排斥法测定细胞活性（Lee等，2015）。将30%和50%乙醇洗脱液稀释至50至400 μg/mL的不同浓度。将3T3-L1前脂肪细胞以1 × 10^3个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并与30%和50%乙醇洗脱液共孵育24小时。然后，用台盼蓝染色3分钟，并在显微镜下计数。细胞活性通过公式（1）表示。![]()
细胞增殖实验采用MTT法进行。简而言之，在30%或50%乙醇洗脱液孵育24小时后，移除培养基，并向3T3-L1细胞中加入MTT（5 mg/mL）继续孵育4小时（Liang等，2013）。随后，移除MTT溶液，并向每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臢。使用分光光度计在490 nm波长下检测吸光度，以空白培养基作为正常对照（NC）。根据既往报道（Gao等，2022），采用比色法进行胰脂肪酶抑制剂活性实验。简而言之，将50 mg胰脂肪酶溶解于50 mL含有5 mM氯化钙的Tris-HCl缓冲液（pH 7.2，0.1 M）中。将混合酶液在4°C下以4000 rpm离心15分钟，取上清液备用。将CAVAF溶解于蒸馏水中，并稀释至一系列浓度（从1.000 mg/mL至0.0625 mg/mL）。取200 μL CAVAF样品与50 μL脂肪酶上清液在37°C下孵育20分钟。然后，加入50 μL pNPB溶液（6 mM，溶解于Tris-HCl缓冲液中）作为底物溶液，并在37°C下继续孵育30分钟。最后，使用分光光度计在405 nm波长下测量吸光度。以奥利司他作为阳性对照，等体积的Tris-HCl缓冲液作为正常对照。胰脂肪酶抑制活性通过公式（2）表示：![]()
其中，Asample表示样品-脂肪酶-pNPB混合物的吸光度，Ablank表示样品-pNPB混合物的吸光度，A100%表示脂肪酶-pNPB混合物的吸光度，A0%表示仅pNPB溶液的吸光度。中国传统医学系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）是一个经典的网络药理学数据库，用于筛选中草药中的精确活性化学成分。该平台整理了化学物质、靶点和药物-靶点网络以及相关的药物-靶点-疾病网络之间的交叉引用。在TCMSP中筛选CAVA的活性成分，并与UPLC/MS分析的结果进行合并。此外，还使用Swiss Target Prediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/）提供补充的候选化合物。最终，根据Swiss Target Prediction数据库中DL ≥ 0.18和OB ≥ 30%的评估标准，筛选出潜在的化学物质及其对应的靶点。对2.5中收集的化合物相关靶点的名称进行校正，校正依据为Universal Protein（UniProt，https://www.uniprot.org/）数据库和String数据库（https://string-db.org/）。筛选限制为主题词“Homo sapiens”和“Reviewed”，并通过Cytospace软件（中国，BLOOMAGE BIOTECH）可视化化合物-靶点网络。以“obesity”和“overweight”为关键词，在Drugbank（https://www.go.drugbank.com/）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIN，https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）和Therapeutic Target Database（TDD，http://db.idrblab.net/ttd/）等数据库中检索肥胖相关靶点。将肥胖相关靶点的名称也从蛋白质转换为基因。通过比较，确定化合物相关靶点和肥胖相关靶点的共享靶点。2.10. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建为了量化共享靶点之间相互作用的强度，将它们全部上传至String数据库进行PPI分析。以“Homo sapiens”作为物种限定词，置信度评分≥0.7作为参考区间。将结果导入Cytospace软件，并输出相应的度值图。为了掌握2.12中选定靶点的相关信号通路和生物功能，应用了Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析。将化合物和交集靶点同步到Metascape数据库（http://metascape.org），并将物种限制为“sapiens”。最终评估通过在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行。为了验证靶点与生物活性化合物之间的相互作用，使用Discovery studio软件（BIOVIA，中国）进行分子对接实验。从RSCB Protein Data Bank（RSCB PDB，https://www.rcsb.org/）下载目标蛋白的3D结构。在人工去除非必需结构（如水分子）并添加氢原子后，保存校正后的结构以备用。类似地，从PubChem数据库下载生物活性化合物的2D结构。然后，将3D和2D结构同步到Discovery studio软件进行对接实验。最后，以软件的LibDockScore模块作为评估分子对接程度的标准，并保留得分高于90的结果。雄性C57 BL/6 J小鼠（4~5周龄）购自广州南方医科大学实验动物科技发展有限公司（中国广州）。小鼠饲养在特定环境中，温度为22 ± 2°C，湿度为55 ± 10%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。水和食物供应充足。动物福利和实验程序均按照美国国家卫生研究院颁发的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得了南方医科大学实验动物伦理委员会于2022年5月13日的批准（注册号：L2021084）。在研究过程中尽力减少对小鼠的不必要痛苦。经过一周的适应性饲养后，将所有小鼠随机分为6组（n = 8），具体如下：（1）正常饮食（ND）组；（2）高脂饮食（HFD）组；（3）二甲双胍（MET）组（MET 200 mg/kg）；（4）HFD + CAVAF-50（CAVAF 50 mg/kg）组；（5）HFD + CAVAF-100（CAVAF 100 mg/kg）组；（6）HFD + CAVAF-200（CAVAF 200 mg/kg）组。ND组小鼠喂食正常饮食，其余组小鼠喂食高脂饮食直至实验结束。ND组和HFD组小鼠给予生理盐水。所有药物均以固定体积2 mL每日口服一次。每周记录小鼠的体重和食物摄入量。经过24周的治疗后，所有小鼠禁食过夜，然后注射戊巴比妥钠并处死。解剖并收集皮下腰背部白色脂肪组织（dWAT）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和肩胛间棕色脂肪组织（BAT），储存于-80°C或固定于4%多聚甲醛中（4°C）以备后续分析。对所有组织样本进行称重并记录以进行计算。ITT检测在第19周进行。所有小鼠禁食12小时，检测并记录禁食后的血糖水平作为初始血糖（0分钟）。然后，给小鼠腹腔注射胰岛素（0.5 U/kg）。分别在30、60、120分钟时检测并记录血糖水平。最后，分析血糖曲线的曲线下面积。为获取血清，收集血液样本并在4°C下以4000 rpm离心10分钟。然后，根据说明书使用市售试剂盒检测小鼠血清中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量。使用Mindray BS-33OE主机进行低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测。![]()
表1 用于RT-qPCR反应的引物序列。
将固定在4%多聚甲醛中的棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）用流水冲洗。经过脱水、透明和浸蜡后，将样本嵌入石蜡中，然后切成4微米的石蜡切片。随后，对石蜡切片进行H&E染色，以观察病理状态。在此，每个切片至少记录3个随机视野用于统计分析。使用Olyvia 3.3软件处理图片。在二甲苯中脱蜡并在一系列梯度乙醇中复水后，进行免疫组织化学染色。然后，将切片置于EDTA缓冲液（pH 9.0）中进行抗原修复。使用3%的H₂O₂溶液灭活内源性过氧化物酶。接着，用正常山羊血清（5%）在室温下封闭切片1小时，随后与UCP1抗体（1:1000）孵育另1小时。此外，还使用了二抗和3,3'-二氨基联苯胺溶液。使用Nanozoomer数字病理系统进行观察和摄影记录。使用TRIzol试剂从腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中提取总RNA。使用超微量分光光度计（NanoDrop，2000C）检测总RNA的纯度和浓度。随后，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA逆转录成cDNA。使用Fast Star DNA Master SYBR Green I试剂盒（Roche，瑞士巴塞尔）和荧光定量PCR检测系统（Bioer Technology，中国）进行RT-qPCR。最终结果通过2−ΔΔCT方法分析，所有目标基因的表达水平均归一化至GAPDH。用于扩增的引物信息列于表1中。所有数据均使用SPSS 19.0（IBM，美国纽约）和GraphPad Prism 9.0（美国加利福尼亚州圣迭戈）进行分析，并表示为均值±标准差（SD）。统计分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或学生t检验。当P < 0.05和P < 0.01时，认为具有统计学显著性；当P < 0.001和P < 0.0001时，表示具有极显著性差异。3.1. 30%、50%和70%乙醇洗脱液中的黄酮类化合物鉴定高效液相色谱（HPLC）分析显示，30%、50%和70%乙醇洗脱液中分别含有83.94%、85.13%和65.58%的橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷（补充材料表S1和图S1）。超高效液相色谱-质谱（UPLC/MS）分析表明，在30%、50%和70%乙醇洗脱液中分别鉴定出19、21和22种化合物（补充材料表S2-S4）。因此，选择黄酮类含量高于70%乙醇洗脱液的30%和50%乙醇洗脱液进行进一步研究。尽管当前数据为CAVA（某种植物缩写，具体根据上下文确定）花提取物的化学特征提供了一定的理论基础，但进一步的研究仍需标准化合物来表征代代花提取物中的化学成分。台盼蓝染色显示，在浓度低于400 μg/mL时，30%和50%乙醇洗脱液对3T3-L1细胞的细胞活力没有显著抑制（图1A）。MTT检测显示，30%和50%乙醇洗脱液均能显著抑制3T3-L1细胞的增殖，且在最低浓度50 μg/mL时即观察到显著抑制（图1B）。显然，当浓度≥100 μg/mL时，30%乙醇洗脱液对3T3-L1细胞增殖的抑制率高于50%乙醇洗脱液。简而言之，当用30%乙醇洗脱液处理时，在50、100、200和400 μg/mL浓度下，3T3-L1细胞的存活率分别为84.00 ± 2.00%、78.57 ± 2.08%、82.33 ± 3.06%和81.50 ± 1.50%。这些结果初步表明，30%乙醇洗脱液可能具有更大的抗肥胖潜力。因此，将具有高黄酮含量和更大抗肥胖潜力的30%乙醇洗脱液识别为CAVAF，并筛选其进行进一步的生物活性研究。如图1C所示，随着浓度的增加，CAVAF对胰脂肪酶的抑制作用先降低后增加。简而言之，当CAVAF的浓度从0.0625增加到0.25再增加到1 mg/mL时，胰脂肪酶的抑制率从37.87%降低到12.32%，然后又增加到48.52%。重要的是，在1 mg/mL时，CAVAF的抑制率接近奥利司他阳性对照组（56.94%）。这一数据进一步暗示CAVAF具有潜在的减重效果。3.4. 从CAVAF中筛选出的五种生物活性化合物结合TCMSP和Swiss Target Prediction数据库的搜索结果，我们选定了包括(Rac)-橙皮素、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素和圣草酚在内的五种化合物（表2和补充材料图S2）。CAVAF的超高效液相色谱-质谱（UPLC/MS）图谱以及所选五种化合物的化学结构如图2所示。![]()
图1. 30%和50%乙醇洗脱液对3T3-L1细胞存活率（A）和增殖（B）的影响；CAVAF对胰脂肪酶活性的影响（C）。结果表示为平均值±标准差。与对照组相比，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001。![]()
表2 活性成分信息。
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图2. CAVAF的超高效液相色谱-质谱（UPLC/MS）图谱及CAVAF中5种主要化合物的化学结构。从左至右的化合物分别为圣草酚、新橙皮苷、(Rac)-橙皮素、柚皮素和橙皮素。
在TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中搜索了与5种化合物相关的药物靶点。根据所有数据库中信息的汇总，保留了44个药物相关靶点（补充材料表S5）。此外，图3A展示了组分-靶点网络的构建，突出了柚皮素、(Rac)-橙皮素和圣草酚作为CAVAF中对抗肥胖的前3种潜在化合物。类似地，使用关键词“Obesity（肥胖）”或“overweight（超重）”从数据库中收集了682个肥胖相关靶点。然后，使用韦恩图分析了CAVAF与肥胖相关靶点之间的重叠靶点（图3B）。最终，获得了16个候选靶点（补充材料表S6）。3.6. CAVAF针对肥胖的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和候选靶点通过STRING数据库建立了PPI网络，并由于与其他靶点无交集而剔除了MAOB靶点。因此，剩下了16个候选靶点。如图3C所示，校正后的PPI网络由16个节点、62条边组成，平均节点数为7.75。根据拓扑分析，通过度值评估了相互作用的强度。基于度值，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、雌激素受体（ESR1）、脂联素（ADIPOQ）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）、载脂蛋白B-100（APOB）、固醇调节元件结合蛋白1（SREBF1）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、脂肪酸合成酶（FASN）、血红素加氧酶1（HMOX1）和细胞色素P450 19A1（CYP19A1）是前10个靶点（表3），可能在抗肥胖中发挥关键作用。采用GO生物过程与KEGG通路富集分析来揭示候选靶点预防肥胖的相关生化过程和信号通路。GO分析的结果如图3D-F所示。主要的分子功能条目是核受体活性和类固醇结合（图3D）。主要的生物过程条目是小分子代谢过程的调节、血浆脂蛋白颗粒水平的调节和类固醇代谢过程（图3E）。细胞组分条目的结果包含被覆囊泡膜和调节复合物（图3F）。KEGG分析特别强调了AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路（图3G），这随后成为本研究的主要焦点。![]()
图3. 构建治疗肥胖的组分-靶点及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并对16个潜在靶点进行GO生物过程和KEGG通路富集分析：（A）CAVAF中44个靶点和5种化合物的化合物-靶点网络；（B）CAVAF与肥胖之间潜在靶点的韦恩图；（C）16个候选靶点的PPI网络；（D）GO生物过程分析的分子功能（MF）；（E）GO生物过程分析的生物学过程（BP）；（F）GO生物过程分析的细胞组分（CC）；（G）KEGG富集分析的通路。![]()
3.8. 分子对接结果与挖掘白色脂肪组织（WAT）棕色化相关靶点为验证网络药理学分析的结果，进行了分子对接试验，以探索3.4节所述的前10个靶点与5种成分之间可能的结合情况。使用LibDockScore来评估对接亲和力。分子对接结果表明，所有靶点与5种化合物均表现出优异的结合活性（LibDockScore ≥90），特别是SREBF1、FASN、APOB、ADIPOQ和PPARA（图4A）。为挖掘CAVAF中与WAT棕色化相关的靶点，将分子对接的结果与现有研究进行了比较。SREBF1是一种关键的脂生成转录因子，可启动包括脂肪酸、鞘脂和甘油磷脂在内的脂质合成。SREBF1的沉默有助于肥胖患者的脂质代谢稳态（Huang et al., 2022）。FASN是一种主要在肝脏中表达的关键脂生成酶，可由SREBF1激活，并随后催化棕榈酸的合成。据报道，靶向抑制肝脏FASN可有效减少脂肪新生，从而减轻肥胖及其相关并发症的脂质代谢负担（Matsukawa et al., 2023）。类似地，APOB特异性地在肝脏中表达，并在极低密度脂蛋白（VLDL）和甘油三酯（TG）的分泌中发挥关键作用（Lin et al., 2022）。ADIPOQ是一种主要来自脂肪细胞的脂肪因子，作为代谢控制器，通过提高肝脏、骨骼肌和大脑等代谢器官的胰岛素敏感性来发挥作用（Uddin et al., 2021）。转录因子PPARA在脂肪酸氧化的调节中扮演关键角色，此外，众多研究还证明了其对WAT棕色化的积极影响（Yao et al., 2022）。结合上述分析，进一步探究CAVAF与WAT棕色化之间的关系时，应特别关注PPARα。PPARA与5种成分对接的3D结构和2D结合位点如图4B-F所示。3.9. CAVAF改善高脂饮食（HFD）喂养小鼠的肥胖指标根据21周的食物摄入记录，各组小鼠的总热量摄入无显著差异（图5A），表明CAVAF的疗效与饮食摄入无关。如图5B所示，与正常饮食（ND）组相比，HFD喂养导致小鼠从第10周开始体重显著增加。然而，连续21周给予CAVAF显著逆转了这一状况。如图5C所示，各组小鼠对胰岛素注射的反应存在显著差异。具体而言，与HFD喂养组相比，以50和100 mg/kg剂量给予CAVAF的小鼠表现出显著更优的胰岛素耐受性，而以200 mg/kg剂量进行CAVAF干预则未显著改变这一状况（图5D）。还对血清中的脂质水平进行了分析。简而言之，与ND组相比，HFD喂养小鼠的血清总胆固醇（TC）浓度急剧增加（图5E）。然而，以100和200 mg/kg剂量补充CAVAF分别使TC浓度显著降低了35%和17%。以50和100 mg/kg剂量给予CAVAF也显著且急剧地降低了血清中的甘油三酯（TG）浓度，且前者效果更为显著（图5F）。此外，以200 mg/kg剂量进行CAVAF干预显著逆转了HFD喂养导致的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平异常升高（图5G）。这些数据表明，CAVAF可能能够预防HFD喂养小鼠的肥胖和胰岛素抵抗。![]()
图4. 5种化合物与潜在核心靶标的分子对接分析：化合物与靶标之间的结合能热图（A）；二氢黄酮（B）、新橙皮苷（C）、柚皮素（D）、（Rac）-柚皮素（E）和柚皮苷元（F）与PPARA的3D和2D结合图。![]()
图5. CAVAF对高脂饮食（HFD）喂养小鼠肥胖参数的影响：（A）每周食物摄入量（千卡）；（B）21周内体重变化；（C）120分钟内胰岛素耐量试验（ITT）血糖变化曲线；（D）ITT血糖变化曲线的曲线下面积（AUC）；（E）血清中总胆固醇（TC）含量；（F）血清中甘油三酯（TG）含量；（G）血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。每项实验至少重复三次。结果以平均值±标准差表示。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001表示与正常对照组（NC组）相比有统计学差异；P<0.05，P<0.01，P<0.001，****P<0.0001表示与HFD组相比有统计学差异。
3.10. CAVAF改善棕色脂肪组织（BAT）形态如图所示，与高脂饮食（HFD）组相比，给予50 mg/kg CAVAF的小鼠BAT重量显著增加（图6A和B）。H&E染色进一步显示，CAVAF干预减少了BAT中的脂质积累，并提高了脂肪细胞密度（图6C）。图6D显示，CAVAF给药以剂量依赖的方式显著增加BAT中脂肪细胞的数量和核面积比。这些事实表明，CAVAF可能激活BAT并增加能量消耗以对抗肥胖。3.11. CAVAF抑制腹股沟白色脂肪组织（iWAT）的炎症与正常饮食（ND）组相比，HFD喂养小鼠iWAT中IL-6 mRNA的表达水平显著上调（图7A）。然而，50和200 mg/kg的CAVAF治疗显著降低了HFD喂养小鼠iWAT中IL-6的基因表达水平，其中50 mg/kg的CAVAF更为有效。HFD诱导的HFD喂养小鼠iWAT中IL-1β mRNA表达水平的增加被CAVAF添加以剂量依赖的方式显著逆转（图7B）。50 mg/kg的CAVAF给药对HFD喂养小鼠iWAT中TNF-α表达水平的抑制率最高，其次是100和200 mg/kg的CAVAF（图7C）。此外，50、200 mg/kg，尤其是100 mg/kg的CAVAF干预显著且剧烈地上调了HFD喂养小鼠iWAT中IL-10 mRNA的表达水平（图7D）。这些证据表明，CAVAF抑制了HFD喂养小鼠iWAT中由HFD诱导的炎症。3.12. CAVAF促进iWAT的“棕色化”如图8A所示，HFD喂养导致dWAT（背部白色脂肪组织）和iWAT重量显著增加。然而，CAVAF给药显著抑制了这种情况。200 mg/kg的CAVAF干预将总WAT（白色脂肪组织）质量从1.182 ± 0.2588 g显著降低至0.796 ± 0.1232 g（图8B），体脂率从4.15 ± 0.91%降低至2.99 ± 0.46%（图8C）。H&E染色测量显示，与HFD组相比，CAVAF治疗的小鼠在dWAT和iWAT中均表现出更小的脂肪细胞和细胞内脂滴（图8D）。进一步的定量分析证明，CAVAF干预显著增加了HFD喂养小鼠dWAT（图8E）和iWAT（图8F）的细胞数量。HFD喂养小鼠iWAT的免疫组织化学染色表明，CAVAF治疗显著逆转了HFD诱导的UCP1（解耦联蛋白1）减少（图8G）。CAVAF补充后HFD喂养小鼠iWAT中UCP1表达水平的升高暗示CAVAF可能促进iWAT中的米色脂肪生成。进一步的RT-qPCR检测显示，CAVAF添加以剂量依赖的方式显著上调了HFD喂养小鼠iWAT中UCP1 mRNA的表达水平，这与免疫组织化学结果一致（图8H）。HFD喂养显著降低了HFD喂养小鼠iWAT中Cyto C（细胞色素C）（图8I）、ATP合成（图8J）和Cidea（细胞死亡诱导DFFA样效应物a）（图8K）的基因表达水平。如预期所示，CAVAF干预显著逆转了这些变化，其中最小剂量（50 mg/kg）最为有效。CAVAF给药（100和200 mg/kg）也显著且剧烈地增加了HFD喂养小鼠iWAT中Cox8b（细胞色素C氧化酶亚基8B）降低的表达水平（图8L）。这些数据表明，CAVAF治疗显著促进了iWAT的“棕色化”。3.13. CAVAF调节iWAT中PRDM16、PGC-1α、SIRT1、AMPKα1、PPARα和PPARγ mRNA的表达水平图9A显示，HFD喂养导致小鼠iWAT中PRDM16 mRNA的表达水平显著降低。相比之下，CAVAF干预显著抑制了这种情况。与HFD组相比，CAVAF治疗的小鼠还表现出小鼠iWAT中PGC-1α mRNA表达水平的显著增加，其中100 mg/kg的CAVAF治疗更为有效（图9B）。HFD诱导的小鼠iWAT中SIRT1 mRNA表达水平的降低被CAVAF给药以剂量依赖的方式显著上调（图9C）。进一步测定了HFD喂养小鼠iWAT中AMPKα1的mRNA表达水平。如图所示，HFD喂养小鼠iWAT中AMPKα1 mRNA表达水平的降低被显著抑制（图9D）。值得注意的是，100 mg/kg的CAVAF治疗使AMPKα1 mRNA表达水平增加了4.7倍。此外，结果还显示，CAVAF干预显著上调了HFD喂养小鼠iWAT中PPARα mRNA的表达水平，特别是在50 mg/kg的浓度下（图9E）。而且，50、100和200 mg/kg的CAVAF给药在HFD喂养小鼠的iWAT中观察到了PPARγ mRNA表达水平的显著且剂量依赖性的抑制（图9F）。这些发现表明，AMPKα1、PGC-1α、SIRT1、PPARα和PPARγ可能参与CAVAF促进iWAT“棕色化”的机制。![]()
图6. CAVAF对棕色脂肪组织（BAT）的影响：（A）BAT重量；（B）BAT指数；（C）400倍放大倍数下BAT的H&E染色；（D）BAT的相对核面积。每项实验至少接受三个样本。结果以平均值±标准差表示。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001表示与正常对照组（NC组）相比有显著性差异；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001表示与高脂饮食组（HFD组）相比有显著性差异。![]()
图7. CAVAF对腹股沟白色脂肪组织（iWAT）的影响：IL-6（A）、IL-1β（B）、TNF-α（C）和IL-10（D）的相对mRNA表达水平。结果以平均值±标准差表示。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001表示与正常对照组（NC组）相比有显著性差异；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001表示与高脂饮食组（HFD组）相比有显著性差异。![]()
图8. CAVAF对腹股沟白色脂肪组织（iWAT）棕化的影响：（A）皮下白色脂肪组织（dWAT）和iWAT的形态照片；（B）白色脂肪组织（WAT）的总重量；（C）WAT指数；（D）400倍放大倍数下dWAT和iWAT的H&E染色；（E）通过H&E染色和数字化处理获得的dWAT细胞数量；（F）通过H&E染色和数字化处理获得的iWAT细胞数量；（G）iWAT中UCP1的免疫组织化学染色；（H-L）相对于GAPDH，UCP1（H）、细胞色素C（Cyto C）（I）、ATP合成（J）、Cidea（K）和Cox8b（L）的相对mRNA表达水平。结果以平均值±标准差表示。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001表示与正常对照组（NC组）相比有显著性差异；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001表示与高脂饮食组（HFD组）相比有显著性差异。![]()
图9. CAVAF对腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中PRDM16、PGC-1α、SIRT1、AMPKα1、PPARα和PPARγ mRNA表达水平的影响：（A）PRDM16 mRNA（A）、PGC-1α mRNA（B）、SIRT1 mRNA（C）、AMPKα1 mRNA（D）、PPARα mRNA（E）和PPARγ mRNA（F）相对于GAPDH的相对表达水平。结果以平均值±标准差表示。#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001表示与正常对照组（NC组）相比有显著性差异；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001表示与高脂饮食组（HFD组）相比有显著性差异。肥胖以脂肪过度堆积为特征，通常伴随多种并发症，已成为全球性的公共负担（Zheng等，2021）。柑橘类植物在传统中医中常作为消化药物使用，大量研究已证实其具有抗肥胖作用（Tung等，2018）。特别是柑橘类黄酮，作为柑橘植物的主要活性成分，因其对肥胖相关疾病的显著影响而备受关注（Burke等，2018）。在本研究中，从柑橘属植物花中分离并纯化了富含黄酮的提取物（CAVAF），并通过高效液相色谱（HPLC）分析证实，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷占CAVAF的80%以上。累积研究表明，CAVAF中的三种主要黄酮类化合物——柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在减轻体重方面具有显著效果。例如，柚皮苷可通过调节炎症和线粒体功能来逆转代谢综合征（Alam等，2013）。据报道，橙皮苷可通过维持肠道微生物群丰度来减轻肥胖和非酒精性脂肪肝病（Li等，2022）。新橙皮苷可促进PGC-1α表达并激活AMPK，从而减少脂肪堆积（Wang等，2020）。这些事实表明，CAVAF也可能是一种有前景的抗肥胖药物。如预期所料，本研究中的体内和体外实验均证实了CAVAF的降脂和减重效果。白色脂肪组织（WAT）中的慢性炎症是肥胖的重要特征之一（Reilly和Saltiel，2017）。大量研究表明，WAT中过量的脂质积累会招募巨噬细胞浸润，并促进IL-1β和TNF-α等促炎因子的释放（Fantuzzi，2005；Ion等，2023）。促炎细胞因子的分泌可导致肥胖及其并发症的恶化。因此，抑制WAT炎症被认为是缓解肥胖的有效途径。支持这一观点的是，Xu等人发现恩格列净通过促进脂肪利用、WAT褐变以及抑制WAT炎症来预防肥胖（Xu等，2017）。同样，在本研究中，我们发现CAVAF给药显著降低了WAT中IL-6、IL-1β和TNF-α的基因表达水平，而抗炎基因IL-10的基因表达水平则显著增加。这些发现表明，CAVAF可有效抑制WAT中的炎症。有趣的是，CAVAF治疗对IL-6、TNF-α和IL-10基因表达水平未观察到剂量效应。一种可能的解释是，CAVAF是一种富含黄酮的提取物，由多种化合物组成，其功效可能是所有化学成分协同作用的结果。支持这一观点的是，多项研究表明，许多来自传统中药的活性成分的抗肥胖能力归因于其多组分和多靶点的特性（Wu等，2023；Zhao等，2021）。棕色脂肪组织（BAT）是一种通常在新生儿中观察到的用于非战栗产热的脂肪组织。然而，近期研究证实，BAT也存在于成人中，并通过增加能量消耗来促进体重减轻。已证实，WAT可以转化为米色脂肪组织（BAT的一种过渡形式），该过程被称为WAT的褐变。WAT褐变以UCP1表达增加为特征，已被视为一种治疗肥胖的新方法。众多文献已揭示了天然活性成分与WAT褐变之间的相互作用。支持这一观点的是，用于心血管疾病的黄酮类化合物黄芩素对促进WAT褐变具有显著影响（Zhang Y.Q.等，2022）。黄芩素给药可激活肩胛间BAT并促进肥胖小鼠附睾WAT的褐变，同时伴随UCP1表达增加。我们发现，CAVAF治疗显著增加了高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠WAT中UCP1的表达水平。此外，CAVAF给药还显著上调了包括CytoC、ATP合成、Cidea和Cox8b在内的产热基因的表达水平。这些证据表明，CAVAF干预显著促进了WAT的褐变。AMPK是一种能量受体和代谢调节剂，通过调节外周组织代谢、线粒体合成和前脂肪细胞分化来维持能量稳态（Shen等，2017a）。AMPK激活剂可降低体重并增加棕色特异性基因的表达水平（Ma等，2022）。已有研究表明，多种传统中药成分可通过激活AMPK来促进WAT褐变（Zhang Y.Q.等，2022）。AMPK途径被认为是参与WAT褐变的经典信号途径之一（Hou等，2018）。在本研究中，通过网络药理学筛选了CAVAF抗肥胖作用的潜在靶点。结果表明，AMPK途径是CAVAF抗肥胖作用的潜在作用机制。进一步的实验数据证实，CAVAF治疗显著调节了AMPK途径中涉及的主要基因——PRDM16、PGC-1α、SIRT1和AMPKα1 mRNA的表达水平。PPARα是核受体PPAR家族的一员，是一种与脂肪酸代谢相关的关键配体激活转录因子。越来越多的研究揭示了PPARα在抗肥胖中的重要作用。据报道，PPARα的激活剂CYP2E1可通过促进WAT褐变和能量消耗来显著减轻肥胖（Zhang Y.B.等，2022）。在本研究中，分子对接实验表明，PPARα可能是CAVAF主要成分（如儿茶素、新橙皮苷和柚皮素）的理想受体。观察到CAVAF治疗逆转了HFD诱导的肥胖小鼠PPARα mRNA表达的下调，部分表明了CAVAF与PPARα之间的相互作用和关系。PPARα与AMPK之间的相互作用也已得到证实。例如，已发现SIRT1/AMPK/PPARα途径在促进WAT褐变和缓解肥胖中发挥关键作用（Yao等，2022），这与本研究中的一些发现相一致。PPARγ是PPARs的另一种亚型，与脂肪细胞分化调节密切相关（Montaigne等，2021）。尽管普遍认为PPARγ在脂肪生成中发挥关键作用并具有有利的抗肥胖效果，但PPARγ影响脂质代谢的确切机制仍不明确。先前的研究表明，PPARγ激活可促进WAT褐变以缓解肥胖（Zuo等，2017）。然而，新兴研究表明，肥胖也会诱导WAT中PPARγ表达水平增加，这可通过PPARγ抑制剂逆转，并随后促进WAT褐变以治疗肥胖（Heo等，2023）。本研究进一步证明，CAVAF有效降低了HFD喂养小鼠WAT中PPARγ的mRNA表达水平。这些事实表明，CAVAF可能是一种潜在的双重PPAR靶向药物。肠道微生物群由数万亿种共生微生物组成，被视为人体内的一个独特器官。肠道微生物群的平衡可作为生理功能障碍，特别是代谢紊乱的指标（Liu等，2021）。本研究结果表明，CAVAF干预显著促进了HFD喂养小鼠WAT的褐变。然而，传统中药通常具有多组分和多靶点的特性。CAVAF是否可通过其他机制发挥抗肥胖作用仍需进一步研究。在我们之前的研究中，发现柑橘属植物花的氯仿提取物可通过调节厚壁菌门与拟杆菌门的比例以及Erysipelotrichaceae和Lachnospiraceae的丰度来减轻肥胖（Li等，2021）。有趣的是，在柑橘属植物花氯仿提取物中鉴定出的6种主要化合物中有5种是黄酮类化合物，包括已明确与肠道微生物群有相互作用的橙皮苷（Li等，2022）。因此，有必要进一步研究CAVAF对HFD诱导的肠道微生物群失衡的影响及其潜在机制。芸香科植物是鉴定具有抗肥胖作用的天然成分的重要来源，其主要成分包括生物碱、黄酮和挥发油（Shen等，2017b）。然而，越来越多的研究表明，应考虑芸香科植物中生物碱的副作用。例如，Yamashita等人证明，来源于吴茱萸（Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.）的生物碱——吴茱萸碱在肥胖小鼠中表现出优异的抗肥胖活性，但并未延长其寿命，甚至导致体重过轻（Yamashita等，2015）。辛弗林是柑橘属植物的主要生物碱成分之一，也在本研究中通过UPLC/MS在CAVAF中鉴定出。尽管近期研究证实了辛弗林在减少肥胖方面的有效性，但其副作用仍令人担忧。例如，Rossato等人报道，辛弗林膳食补充剂可能诱发心脏不良事件，如高血压、心动过速和变异型心绞痛（Rossato等，2011）。因此，仍需深入研究以探索CAVAF在WAT褐变中的确切作用，包括其安全性。此外，本研究还存在一定不足。为探索CAVAF与WAT褐变的相互作用，除PPARα外，忽略了CAVAF的其他潜在靶点，尽管这些靶点直接参与调节血脂或胰岛素敏感性。然而，数据显示，CAVAF给药后，HFD诱导的肥胖小鼠的血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平以及胰岛素耐量也有所改善。考虑到肝脏是其他潜在靶点（如SREBF1和ADIPOQ）发挥作用的主要部位，有必要进一步研究CAVAF对肝功能的影响。综上所述，基于较高的黄酮含量以及通过体外胰腺脂肪酶和3T3-L1细胞实验所展现出的优异抗肥胖效果，30%乙醇洗脱物被视为柑橘抗肥胖黄酮（CAVAF）。通过超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC/MS），我们在CAVAF中鉴定出了19种化合物，其中特别强调了5种具有抗肥胖潜力的活性化合物，包括（外消旋）-橙皮素、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素和儿茶素。网络药理学和分子对接实验的结果表明，AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是CAVAF改善肥胖的候选靶点。动物研究数据显示，CAVAF干预显著减轻了高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的肥胖参数。进一步研究揭示，CAVAF治疗显著提高了肥胖小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中解耦联蛋白1（UCP1）以及棕色脂肪特异性基因（包括PRDM16、PGC-1α、SIRT1、AMPKα1、PPARα和PPARγ）的表达水平，这强烈表明CAVAF可能至少部分通过促进白色脂肪的棕色化来预防肥胖。这一发现暗示了CAVAF作为预防肥胖及其相关疾病的膳食补充剂的潜在应用价值。
