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摘要
免疫疗法可以使部分癌症患者获得长期生存，然而，由于抗原呈递不足以及免疫原性细胞被排除在肿瘤微环境之外，其普遍成功受到了阻碍。在本研究中，我们开发了一种方法，通过腺病毒递送转录因子PU.1、IRF8和BATF3，在体内对肿瘤细胞进行重编程，使它们能够像1型传统树突状细胞那样呈递抗原。经过重编程的肿瘤细胞重塑了肿瘤微环境，募集并扩增了多克隆细胞毒性T细胞；诱导了肿瘤消退；并在多个小鼠黑色素瘤模型中建立了长期系统免疫。在人类肿瘤球体和异种移植模型中，向免疫原性树突状样细胞的重编程过程不受免疫抑制的影响，而免疫抑制通常会限制免疫治疗的疗效。我们的研究为癌症免疫治疗中体内免疫细胞重编程的人体临床试验铺平了道路。
引言
癌症免疫疗法依赖于由肿瘤抗原特异性T淋巴细胞驱动的免疫反应的建立（1）。T细胞识别肿瘤细胞主要组织相容性复合体（MHC）上呈现的抗原，并通过产生炎症细胞因子和杀死肿瘤细胞来发挥其效应功能（2, 3）。然而，由于抗原呈递途径的下调、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的形成，以及专业抗原呈递细胞（包括树突状细胞（DCs），这些细胞能够捕获并向T细胞呈递肿瘤抗原）的缺乏或功能障碍，肿瘤细胞往往无法激活T细胞（1）。因此，目前的癌症免疫疗法难以取得普遍成功。例如，免疫检查点阻断（ICB）彻底改变了实体瘤的治疗方法，但目前接受抗程序性细胞死亡蛋白1（抗PD-1）和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（抗CTLA-4）治疗的黑色素瘤患者的响应率仅为60%（4）。其他低免疫原性的癌症类型对免疫疗法更具抗药性，包括乳腺癌、微卫星稳定的结直肠癌和胶质母细胞瘤，这些癌症中，仅有不到5%的患者能产生长期免疫（5–7）。越来越多的证据表明，1型传统树突状细胞（cDC1s）对于多种癌症类型中T细胞介导的肿瘤消退和ICB响应至关重要（8–11）。cDC1s是DCs的一个稀有亚群，成熟后表达高水平的MHC I类和II类（分别为MHC-I和MHC-II）、共刺激分子CD40以及cDC1亚群特异性标记XCR1和CLEC9A（12）。在肿瘤中，cDC1s通过趋化因子分泌和抗原交叉呈递在T细胞的募集和激活中发挥关键作用（13），从而介导有效的抗癌免疫（14）。然而，cDC1s的这些特殊功能特性尚未被用于免疫治疗。细胞重编程提供了一种策略，即通过强制表达转录因子组合在体内生成特定的细胞类型（15）。体内细胞命运重编程能够将内源性体细胞转化为另一种细胞身份，直接在疾病部位产生治疗效果。这一策略有望克服个性化细胞疗法中体外细胞制备的重大挑战。例如，已有研究表明，通过腺病毒（Ad）载体向胰腺递送三种转录因子，可将小鼠胰腺外分泌细胞原位转化为分泌胰岛素的β细胞（16）。在小鼠心肌梗死模型中，瘢痕形成的心脏成纤维细胞被转化为心肌细胞，从而改善了心脏功能（17）。在脑损伤或神经退行性疾病模型中，胶质细胞被转化为功能性神经元（18），并在视网膜内生成视杆光感受器，从而改善视力（19）。然而，体内重编程可能与体外的转化过程不同。研究表明，由于生化和机械信号的存在，在体内生成的胰岛素产生β细胞和心肌细胞具有更好的功能特性（16, 17）。此外，Ngn2、Dlx2或NeuroD1等转录因子在体外和体内诱导星形胶质细胞向神经元转化的过程中被差异使用（20）。这些研究中报告的转录因子组合要求和细胞成熟度的差异表明，体内环境影响重编程过程，强调了表征体内重编程机制和诱导表型的必要性。我们之前发现，由PU.1、IRF8和BATF3（PIB）组成的转录因子组合足以在体外将成纤维细胞或肿瘤细胞重编程为cDC1样细胞。这些细胞具有激活T细胞所需的三种信号，包括MHC-I和MHC-II上的抗原呈递、共刺激分子表达以及趋化因子和细胞因子分泌（21–23）。在本研究中，我们假设PIB能够在TME中完全在体内介导肿瘤细胞向免疫原性cDC1样细胞的重编程。我们的研究结果表明，cDC1重编程在体内原位进行，并导致强大、持久和全身性的抗肿瘤免疫，且不依赖于外源性刺激，这为在体内诱导抗原呈递和cDC1功能，并启动肿瘤抗原特异性免疫反应提供了一种可行的策略。为了评估cDC1原位重编程作为癌症免疫疗法的可行性，我们首先评估了PIB转录因子是否足以在不依赖人工抗原或外源性刺激的情况下，驱动肿瘤细胞在肿瘤微环境（TME）中向免疫原性cDC1样细胞进行体内重编程，然后表征了诱导的免疫机制。随后，我们在球体细胞和异种移植模型中评估了人类癌细胞的重编程，并确定了一种病毒载体，用于将转录因子递送到肿瘤中，作为一种基于原位cDC1重编程的基因治疗方法（图1A）。首先，我们旨在验证在缺乏体外Toll样受体3（TLR3）刺激的情况下，重编程细胞驱动系统性免疫的能力（23），这对于仅通过表达PIB重编程因子介导的局部免疫治疗方法的成功至关重要。我们使用了低免疫原性的小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10（B16），其特征为MHC低表达和抗ICB治疗，以及免疫原性细胞系B2905，该细胞系模拟高度突变的黑色素瘤肿瘤（23, 24）。首先，为了评估系统性免疫，我们在同一只野生型（WT）C57BL/6J动物的双侧建立了表达模型抗原卵清蛋白（OVA）的皮下B16肿瘤，并建立了一个异种Lewis肺癌（LLC）肿瘤。然后，我们将体外重编程的、用OVA和TLR3激动剂聚肌胞苷酸[P(I:C)]刺激的B16衍生细胞注射到右侧肿瘤中，同时给予全身性抗PD-1和抗CTLA-4治疗。使用编码PIB的慢病毒（LV）多顺反子载体诱导重编程为cDC1样细胞，后接内部核糖体进入位点（IRES）和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）以追踪转导细胞（图1A）（23）。使用eGFP转导的细胞作为LV介导的免疫原性的对照。两个B16-OVA肿瘤均显示出肿瘤生长的明显减少（图S1A），而LLC肿瘤则没有，这表明了系统性和抗原特异性抗肿瘤免疫（图S1，B和C）。接下来，我们研究了诱导的免疫是否依赖于P(I:C)刺激和人工OVA抗原。因此，我们建立了B2905肿瘤，并给予了P(I:C)刺激或未刺激的B2905衍生的重编程细胞。两者均导致肿瘤生长延迟和相似的中位生存期（MS）（图S1D）。这些数据说明了cDC1重编程能够不依赖于外源性刺激和高度免疫原性模型抗原的存在而诱导抗肿瘤免疫。为了测试体内cDC1重编程的抗肿瘤效果，我们在转导后16小时皮下植入了88% PIB-eGFP转导的B16细胞和12%未转导的亲本细胞的混合物，或作为对照的eGFP转导细胞和亲本细胞的混合物（图S2，A和B）。这种策略使我们能够将转录因子的递送与体内重编程过程分开。我们观察到30%的动物出现完全缓解（CRs），其余动物的肿瘤生长延迟，从而延长了MS（43天对比19天；P < 0.0001）。我们在肿瘤消退部位检测到了白斑（图S2C），这表明针对黑色素瘤抗原的细胞毒性反应被诱导（23）。当与抗PD-1和抗CTLA-4联合使用时，我们观察到所有动物的肿瘤均消退（图S2B）。我们确认了转录因子有效递送到肿瘤细胞，并确认了在体内植入前没有发生表型重编程（图S2，D至F）。为了确定cDC1的功能特性是否对观察到的强效抗肿瘤免疫至关重要，我们将cDC1重编程与由PU.1和C/EBPa介导的髓系重编程进行了比较，后者诱导巨噬细胞样细胞（25）（图S2，A至F）。在体内，与巨噬细胞重编程相比，cDC1重编程延长了MS（43天对比29.5天；P < 0.0001），特别是当与ICB联合使用时（P = 0.0003），导致了100%的CRs（图S2B）。这一效应与PIB选择性诱导高水平的MHC-I和MHC-II（图S2，G和H）以及交叉呈递能力（图S2I）相一致。我们接下来通过双侧肿瘤挑战实验（图S3，A和B）确认，体内cDC1重编程与ICB联合使用可诱导系统性免疫。这导致了治疗和非治疗肿瘤的减少，以及外周血中识别黑色素瘤肿瘤抗原PMEL、TRP-2和p15E的细胞毒性T细胞的系统性扩增（图S3，A至C）。接下来，我们使用B16、B2905和额外的黑色素瘤模型YUMM1.7（该模型对ICB耐药，并且也依赖于cDC1的可用性）（11, 24, 26），研究了体内cDC1重编程作为单一疗法或与抗PD-1或抗CTLA-4联合使用的效果。我们植入了转导细胞和亲本黑色素瘤细胞1:1的混合物（图S3，D和E），并观察到单一疗法在YUMM1.7（100% CRs）和B2905（80% CRs）中诱导了肿瘤消退，并将B16挑战动物的MS从17天延长到31天（图1B）。cDC1重编程与抗PD-1或抗CTLA-4治疗协同作用，增加了B16和B2905的CRs，这也导致了外周血中肿瘤抗原特异性干扰素-γ阳性、CD8+（IFN-γ+ CD8+）和IFN-γ+ CD4+ T细胞的扩增（图1C）。为了评估抗肿瘤免疫是否需要内源性cDC1s，我们使用了免疫原性的BRAFV600ECOX1/2KO黑色素瘤模型，该模型由于缺乏内源性cDC1s而在BATF3KO小鼠中生长（13）。我们观察到MS增加（96.5天对比19.5天；P < 0.001）（图1D），与抗PD-1治疗协同作用（50%对比100% CRs），以及肿瘤抗原特异性T细胞的同时扩增（图1E）。为了确定是否诱导了免疫记忆，我们对显示出肿瘤消退的存活者WT或BATF3KO动物进行了再次挑战。虽然未处理的小鼠发生了肿瘤，但存活者动物保持无肿瘤状态（100% YUMM1.7；66% BRAFV600ECOX1/2KO）（图1F和图S3F）。然后，我们研究了是否与ICB联合使用对于系统性抗肿瘤免疫是必需的，并观察到单一疗法或与抗PD-1或抗CTLA-4联合使用时均出现肿瘤特异性远隔效应（图1，G至I）。综上所述，这些发现强调，由PU.1、IRF8和BATF3介导的体内cDC1重编程（i）足以诱导抗肿瘤免疫，（ii）保护免受远端肿瘤生长和（iii）再次挑战后的肿瘤生长，且（iv）其效应不依赖于内源性cDC1s。体内cDC1和髓系重编程系统均诱导了抗肿瘤免疫，这展示了体内细胞重编程作为癌症免疫疗法新方式的潜力。鉴于cDC1在塑造肿瘤微环境（TME）中的作用（9, 27），我们通过免疫荧光和流式细胞术探讨了体内重编程对肿瘤形态和免疫组成的影响。在体内重编程启动后第9天，我们观察到免疫细胞（CD45+）浸润全局性增加，同时转导的肿瘤细胞减少（图S4A）。我们发现，体内重编程导致形成了具有清晰边界的致密淋巴细胞簇，这些簇类似于肿瘤实质中的三级淋巴结构（TLS）（图2A），包含B细胞和CD4+ T细胞区以及空间上分隔的CD8+ T细胞区，这些区域与TLS特异性的podoplanin阳性基质细胞并置（图2B）。在第21天，重编程的肿瘤体积更小，单独治疗或与抗PD-1联合治疗时，CD45+细胞浸润分别增加了2.7倍和1.5倍（图2，C和D）。在淋巴细胞区，B细胞比例增加了24.4倍，自然杀伤（NK）细胞增加了2.2倍，CD4+ T细胞增加了2.4倍（图2E）。尽管治疗组和未治疗组之间CD8+ T细胞的比例相似，但我们发现耗竭型PD-1+ CD8+和PD-1+ CD4+ T细胞显著减少，分别减少了4倍和8倍（图2F）。相反，我们观察到中央记忆型CD62L+ CD44+ CD8+ T细胞增加了4.3倍，这类细胞对长期记忆至关重要（28），同时效应型CD44+ CD4+ T细胞增加了2.2倍（图2G）。我们发现增殖性Ki-67+ CD8+ T细胞的比例增加了2.3倍，TCF-1+ CD8+ T细胞增加了1.7倍，TCF-1+ CD4+ T细胞增加了2.5倍（图2，H和I），这些细胞在长期肿瘤生长控制中发挥作用（13）。我们观察到调节性CD8+和CD4+ T细胞（Tregs）分别减少了10.5倍和1.5倍，这表明肿瘤内cDC1的体内重编程促使免疫细胞群向促炎方向转变（图2，J和K）。在髓系细胞中，重编程使XCR1+ cDC1增加了6.9倍，SIRPa+ cDC2增加了2.1倍，Siglec-H+ 浆细胞样树突状细胞（DC）增加了3.5倍，Ly6C+ 单核细胞增加了2倍，而F4/80+ 巨噬细胞减少了1.4倍（图S4B）。我们观察到髓系细胞（包括DC、巨噬细胞和中性粒细胞）上PD-L1的表达更高，这反映了炎症的存在（29）（图S4C）。接下来，我们分析了肿瘤引流淋巴结（tdLN）中的淋巴细胞群，并观察到CD4+ T细胞的扩增（eGFP 23.6 ± 2.3% vs PIB-eGFP 29.0 ± 4.9%），而CD8+ T细胞、B细胞或NK细胞未见明显变化（图2L和图S4D）。关于诱导产生的cDC1样细胞的功能状态，我们未在淋巴结（LN）中检测到它们的存在（图S4E）、CCR7的表达（图S4F）或迁移状态相关基因表达的激活（图S4G）。相反，我们检测到了驻留cDC1程序的激活（14），这进一步得到了它们在肿瘤中至少存在9天的证据支持（图S4，E和G）。免疫组成的全局性变化促使我们从功能上研究单个效应细胞群对肿瘤控制的贡献。我们首先通过在免疫缺陷的NOD.Cg-PrkdcSCID Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）动物中诱导体内重编程，证实了淋巴细胞对重编程介导的肿瘤控制至关重要（图S4H）。尽管与eGFP对照组相比，小鼠的中位生存期（MS）有所延长（第18天，P=0.01），但小鼠在移植后第30天仍未存活。这可能是由于重编程细胞的增殖能力降低（图S4I）（23）。接下来，我们在野生型（WT）小鼠中用抗体耗竭CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞（图S4J），并观察到耗竭CD4+ T细胞可消除肿瘤免疫控制，从而突出了CD4+ T细胞在PIB介导的抗肿瘤免疫中的关键作用（图2M）。尽管NK细胞的耗竭对肿瘤生长没有影响，但CD8+ T细胞的耗竭在40%的动物中降低了后期时间点的肿瘤控制（图2M）。总之，我们的数据表明，体内cDC1重编程可重塑TME，诱导TLS样结构的形成，减少耗竭型和调节性免疫细胞群，并增加记忆型和干细胞样T细胞的浸润。![]()
图1. 体内cDC1重编程诱导全身性和持久的抗肿瘤免疫。(A) 使用多顺反子慢病毒（LV）载体编码PIB后接IRES-eGFP，在体内诱导cDC1重编程的实验策略。首先，通过植入经转导的癌细胞和未转导的亲代细胞的混合物来测试体内cDC1重编程，以评估抗肿瘤免疫。其次，在包含免疫抑制细胞的球体和异种移植中对人类癌细胞进行重编程。第三，测试LV、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）作为癌症基因治疗，将PIB递送到原位肿瘤。(B) 将经PIB-eGFP或对照eGFP转导后，与亲代细胞按1:1混合（第3天流式细胞术测定的百分比已标示）的黑素瘤细胞（B16、YUMM1.7和B2905）皮下注射到C57BL/6J小鼠体内，以在建立肿瘤的同时诱导体内肿瘤细胞重编程。在第7、10和13天，通过腹腔注射给予抗PD-1、抗CTLA-4或同型对照抗体。显示了肿瘤生长和存活情况（n=5）。(C) 第14天，用抗原非特异性方法（使用IFN-γ刺激的黑素瘤细胞系）在体外重新刺激并分离外周血中的肿瘤抗原特异性IFN-γ+ CD8+或IFN-γ+ CD4+ T细胞，通过流式细胞术定量。数据表示4至5个生物学重复实验的平均值±标准差。(D) 向BATF3KO小鼠注射经PIB-eGFP或eGFP转导的BRAFV600ECOX1/2KO黑素瘤细胞后的肿瘤生长和存活情况（n=5至6）。(E) 用(C)中应用的抗原非特异性方法，从外周血中定量肿瘤抗原特异性IFN-γ+ CD8+或IFN-γ+ CD4+ T细胞。数据表示4至6个生物学重复实验的平均值±标准差。(F) 在无肿瘤存活100天的C57BL/6J幸存小鼠中，皮下再次接种YUMM1.7细胞。使用年龄匹配的未经处理小鼠作为对照，并显示肿瘤生长和存活情况（n=5）。(G) 将1:1混合物注射到治疗侧（右侧）作为单一疗法（PIB-eGFP）或与抗PD-1或抗CTLA-4联合使用，同时将未转导细胞注射到非治疗侧（左侧），观察双侧YUMM1.7肿瘤生长（n=10）。(H) 同一动物体内对照LLC肿瘤的生长情况。(G)和(H)中的数据表示10个生物学重复实验的平均值±标准差。(I) 具有双侧YUMM1.7（治疗和非治疗）和LLC肿瘤的动物代表图片。箭头指示肿瘤位置，虚线表示肿瘤大小。(B)、(D)和(F)中的存活分析采用对数秩Mantel-Cox检验。(C)、(E)、(G)和(H)的比较采用Mann-Whitney检验。ns，无显著性；P<0.05；P<0.01；P<0.001；****P<0.0001。![]()
图2. cDC1重编程重塑肿瘤微环境（TME）。(A) 石蜡包埋的YUMM1.7肿瘤在皮下植入经PIB-eGFP或对照eGFP转导的细胞（转导细胞与亲代细胞的比例为1:2）9天后的苏木精和伊红（H&E）染色（上）和免疫荧光（下）分析。肿瘤切片用eGFP（绿色，转导细胞）、CD45（紫色，免疫细胞）和核（蓝色，Syto 13）染色（n=3）。箭头指示类似三级淋巴结构（TLS）的结构。比例尺为500毫米。(B) PIB-eGFP肿瘤中TLS的H&E（左）和免疫荧光（右）图像，用CD19（B细胞）、CD4（CD4+ T细胞）、CD8（CD8+ T细胞）和PDPN（podoplanin阳性基质细胞）染色。虚线表示TLS边界。比例尺为100毫米。(C) YUMM1.7肿瘤建立后21天的体积，在第7、10和13天给予抗PD-1（灰色和蓝色）或同型对照（黑色和红色）抗体治疗（n=8至10）。(D和E) 肿瘤浸润CD45+细胞（D）以及CD19+ B细胞、CD49b+ CD3- NK细胞、CD8+和CD4+ T细胞（E）的流式细胞术定量。(F) PD-1+ CD8+和PD-1+ CD4+ T细胞的定量。(G) CD44+ CD62L-效应记忆细胞和CD44+ CD62L+中央记忆CD8+和CD4+ T细胞的百分比。(H至K) Ki-67+增殖细胞（H）、TCF-1+ CD8+和TCF-1+ CD4+ T细胞（I）、PD-1+ CD25+调节性CD8+ T细胞（J）和CD25+ CD4+ Tregs（K）的定量。(L) 肿瘤引流淋巴结（tdLNs）中CD8+和CD4+ T细胞的百分比。(C)至(L)中的数据表示8至10个生物学重复实验的平均值±标准差。(M) 小鼠经抗体介导耗竭CD8+ T细胞（aCD8）、CD4+ T细胞（aCD4）、NK细胞（aNK1.1）或同型对照处理，并用转导和未转导的YUMM1.7细胞混合物建立肿瘤。显示了肿瘤生长（左）和存活情况（右）（n=10）。(C)至(L)的比较采用Mann-Whitney检验分析。P<0.05，P<0.01，P<0.001，****P<0.0001。
为进一步表征体内cDC1重编程所诱发的T细胞反应，我们利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合T细胞受体（TCR）富集技术，对来自肿瘤、肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和外周血的T细胞进行了分析（图3，A和B，以及图S5A）。我们将表达CD8a或CD4的单细胞进行分离（图S5B），并进行了聚类注释（图S5C）。我们鉴定出9个CD8+ T细胞簇（图3C；图S5，C和D；以及数据S1），并观察到在经PIB处理的肿瘤中，肿瘤内效应细胞和效应记忆细胞的频率增加，同时耗竭和终末耗竭亚群减少（图3C）。在单药治疗环境下，通过PD-1（Pdcd1；图S5D）、TIM-3（Havcr2）和Cd101表达降低，以及联合抗PD-1治疗时Lag3表达进一步降低，证实了CD8+ T细胞耗竭减少（图S5E）（30）。事实上，当体内重编程与抗PD-1治疗联合使用时，效应细胞和干细胞样CD8+ T细胞的频率被放大。这些差异促使我们探究CD8+ T细胞在接触重编程细胞时是否会遵循不同的分化路径。在对照eGFP肿瘤中，轨迹分析显示，早期活化和增殖的CD8+ T细胞主要分化为效应细胞、耗竭细胞和终末耗竭细胞（图3D）。如先前报道（31），抗PD-1治疗也促进了向耗竭和终末耗竭亚群的分化，但体内重编程有利于效应和记忆细胞的分化，导致耗竭和终末耗竭T细胞减少（图3D）。我们还鉴定出11个CD4+ T细胞簇（图3E和图S5，F和G）。在经体内重编程治疗的肿瘤中，我们观察到一个大的细胞毒性CD4+ T细胞簇，这类细胞已被证实具有直接清除黑色素瘤细胞的能力（3）（图3E）。当与抗PD-1联合使用时，CD4+ T细胞向T辅助（TH）前体、1型TH（TH1）和干细胞样命运转变，这表明这些细胞群的动力学或启动存在差异。我们还观察到耗竭性和调节性CD4+ T细胞的频率降低。轨迹分析显示，接触重编程细胞的CD4+ T细胞主要通过TH前体分化为效应细胞毒性细胞和TH1细胞（图3F）。为解决是否诱导了多克隆扩增的问题，我们分析了从单个T细胞获得的全长ab TCR序列，每个克隆型包含不止一个细胞。首先，我们观察到在经体内重编程治疗和对照治疗的肿瘤中，CD8+ T细胞的多克隆扩增相似（分别有118和112个独特克隆）（图3，G和H）。与eGFP肿瘤相比，PIB治疗肿瘤中扩增的克隆主要位于效应细胞（44.4% vs 30.1%）和效应记忆CD8+ T细胞亚群（4.8% vs 0.1%）（图S6，A和B）。我们观察到160个独特CD4+ T细胞克隆的扩增，而在对照肿瘤和抗PD-1治疗的肿瘤中分别仅发现57和92个（图3，I和J）。在PIB治疗的肿瘤中，59.6%的扩增克隆为细胞毒性细胞，32.9%为TH1 CD4+ T细胞（图S6，C和D）。相比之下，联合抗PD-1治疗减少了CD4+ T细胞的克隆扩增（53个独特克隆）。为验证经体内重编程的肿瘤中CD4+ T细胞的细胞毒性潜力，我们进行了体外杀伤试验，并观察到对黑色素瘤细胞的有效和特异性杀伤（图S6，E至I）。在外周血中，我们观察到29个CD4+ T细胞克隆的扩增，而对照小鼠和抗PD-1治疗小鼠中分别为14和19个（图3，I和J）。这些系统循环的克隆大多被鉴定为T滤泡辅助（TFH）细胞，这是支持B细胞反应、生发中心和TLS形成的CD4+ T细胞亚群（图S6C）（27）。这些结果共同进一步强调了多克隆CD4+ T细胞对肿瘤控制的重要性，这与免疫耗竭实验的结果相一致（图2M）。环境信号可影响重编程过程（16, 17），因此我们评估了人癌细胞在体内是否能获得免疫原性cDC1表型。我们在NSG小鼠中建立了人黑色素瘤（A375和A2058）和胶质母细胞瘤（T98G）肿瘤，并使用流式细胞术对体内重编程过程进行了表型特征分析（图4A和图S7A）。在第9天，我们检测到了重编程的CD45+ HLA-DR+ T98G（75.36 ± 11.84%）、A375（69.93 ± 11.45%）和A2058（76.97 ± 7.24%）细胞，以及表达CD45或HLA-DR的部分重编程细胞（图4，B和C，以及图S7B）。我们观察到从第3天到第9天，重编程细胞的百分比逐渐增加，不仅显示了体内重编程过程的启动，还显示了其进展，这与体外观察结果一致（23）。作为重编程保真度的一项指标，我们评估了cDC1特异性表面标志物XCR1、CLEC9A和CD226的表达（图4D和图S7C），这些标志物先前已被确定为成功cDC1重编程的晚期标志物（22, 23）。在第5天，我们就已观察到T98G来源（8.0 ± 2.5% vs 1.2 ± 1.1%）、A375来源（12.1 ± 6.6% vs 0.4 ± 0.2%）和A2058来源（9.5 ± 6.5% vs 4.8 ± 3.2%）的细胞在体内相较于体外XCR1表达增强（图4D和图S7C）。关于第9天体内诱导细胞的免疫原性，我们检测到重编程的T98G、A375和A2058细胞中HLA I类分子的表达分别提高了4倍、2倍和3倍（图4E）。此外，我们还证实了共刺激分子CD40的获得，这反映了成熟的抗原呈递表型（图4F）。总体而言，我们证明了在人异种移植模型中PIB过表达可在体内诱导具有更高保真度和免疫原性的cDC1表型。为进一步证实树突状细胞1型（cDC1）在包含人类免疫抑制性细胞和肿瘤微环境（TME）可溶性介质的组织中进行重编程的可行性，我们首先从人类癌细胞系中生成球体，并确认了其形态和生长情况（图5A和图S8，A至C）。通过使用高内涵荧光成像和增加感染复数（MOI）的肿瘤细胞转导，我们检测到球体中的转导（mCherry+）和重编程（CD45+和HLA-DR+）增加，并且球体整体尺寸减小（图5B）。这与先前描述的伴随cDC1重编程的增殖和致瘤潜能丧失现象相符（图S4，H和I）（23）。尽管人类不同类型癌症的重编程效率存在差异，但与二维（2D）单层培养相比，每种在三维（3D）条件下进行重编程的细胞系的重编程效率均相似或更高（图5，C和D）。T98G、IGR39和A2058细胞系在球体中的重编程效率更高（图5，C和D），这表明3D环境不仅不会妨碍重编程，反而可能有利于重编程。为验证转录cDC1程序的建立，并揭示2D和3D之间的潜在差异，我们对第3天、第7天和第9天的重编程细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图S8D和数据S2）。转录组分析显示，球体来源的细胞中内源性SPI1、IRF8和BATF3（重编程标记物：PTPRC和HLA-DR）以及cDC1基因（C1orf54、CLEC9A和ZNF366）上调更快（图5E）。与2D培养相比，球体中的重编程细胞在第3天时就表现出与自然cDC1更高的转录相似性，并快速激活了肿瘤-抗原呈递细胞（tumor-APC）基因特征，该特征先前是利用18种人类癌细胞系在重编程过程中常见的上调cDC1基因建立的（23）（图5，F和G）。与此一致，对差异表达基因进行Reactome和基因本体（GO）生物过程分析发现，第3天的差异最大，此时与免疫系统、GTP酶信号传导和细胞粘附相关的术语富集（图S8E）。我们在第9天的球体中检测到淋巴毒素β（LTB）表达增加，支持了三级淋巴结构（TLS）的形成能力（32）（图S8F）。对免疫原性（Toll样受体（TLR）诱导的成熟）或耐受原性（稳态成熟）特征（33）的基因集富集分析表明，在3D重编程过程中，尽管在第3天时稳态成熟基因短暂表达，但聚肌胞苷酸（PIB）仍诱导了免疫原性程序（图S8G）。确实，3D重编程伴随着干扰素（IFN）、干扰素基因刺激因子（STING）和核因子κB（NF-kB）通路的激活（图S8H），反映了成熟的cDC1程序（23）。为评估人类免疫抑制性TME成分对cDC1重编程的影响，我们在含有不同比例的癌相关成纤维细胞（CAFs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）或周细胞的球体中启动了重编程（图5H和图S9A）。CAFs、MDSCs或周细胞的存在并未影响cDC1的重编程效率（图5I和图S9，B和C），而添加抗炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）和免疫调节性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）仅略微降低了重编程效率（图S9D）。最后，我们通过将含有CAFs的球体与HLA-A2匹配或不匹配的外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，量化球体大小（作为细胞毒性的指标）和T细胞反应性标记物（作为T细胞活化的指标），从而评估了重编程癌细胞在球体中的抗原呈递功能。虽然对照组球体未受到非活化PBMCs的影响，但含有重编程细胞的球体尺寸减小（图5J和图S9E），并诱导了PBMC来源的细胞毒性细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和颗粒酶B的分泌（图5K和图S9F）。这些结果共同表明，球体中的cDC1重编程加速了重编程动力学，诱导出免疫原性的cDC1细胞状态，这与小鼠体内重编程的结果一致（图4，B和C）。此外，我们的研究结果表明，cDC1重编程和功能的进展在人类TME中引发了有效的免疫细胞活化和细胞毒性，且不受免疫抑制的影响。![]()
图3. 体内重编程的黑素瘤细胞扩增了多克隆CD4+ T细胞。（A）具有TCR富集的5′ scRNA-seq实验设计。使用PIB-eGFP或对照eGFP转导和未转导细胞以1:1的比例建立YUMM1.7肿瘤。肿瘤建立后21天分离外周血、肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和肿瘤，并在10x Chromium上样前通过FACS纯化CD45+ CD3+ T细胞。其他组在第7、10和13天腹腔注射抗PD-1（n=5）。（B）通过均匀流形近似和投影（UMAP）图可视化外周血、tdLNs和肿瘤（左）中CD8+和CD4+ T细胞在不同处理条件（右）下的主成分分析。（C）UMAP图显示颜色编码的CD8+ T细胞亚群（左）。条形图显示每个CD8+ T细胞亚群在外周血、tdLNs和肿瘤中的百分比（右）。CD8+ T细胞亚群编号为0至8。（D）不同处理条件下CD8+ T细胞的轨迹分析（黑线）。（E）UMAP图显示颜色编码的CD4+ T细胞亚群（左）。条形图（右）显示每个CD4+ T细胞亚群在外周血、tdLNs和肿瘤中的百分比。CD4+ T细胞亚群编号为0至11。（F）不同处理条件下CD4+ T细胞的轨迹分析（黑线）。（G）从外周血、tdLNs和肿瘤中分离的CD8+ T细胞根据克隆型大小分为小克隆（1至5个细胞）、中克隆（5至20个细胞）和大克隆（>20个细胞），并投影到不同处理条件下的UMAP图上。仅在一个细胞中检测到的TCR序列不包括在此分析中。（H）条形图显示外周血、tdLNs和肿瘤中CD8+ T细胞的百分比及其克隆型分布。条形图内的数字表示独特克隆的数量。（I和J）外周血、tdLN和肿瘤来源的CD4+ T细胞克隆型大小投影到UMAP图上（I）和条形图显示CD4+ T细胞的百分比及其克隆型分布（J）。（C）和（E）中的比较使用精确二项式检验进行。显示了eGFP与PIB-eGFP条件以及eGFP+抗PD-1与PIB-eGFP+抗PD-1条件下肿瘤内T细胞的相关统计比较。所有统计比较见数据S1。**P<0.01；****P<0.0001。
接下来，我们旨在确定一个平台，用于将PIB因子递送到肿瘤中，并诱导原位cDC1重编程。我们在单层细胞、球体和原位肿瘤中比较了慢病毒（LV）载体（LV-PIB-eGFP）、非整合且复制缺陷的腺病毒（Ad）（Ad-PIB-eGFP）和腺相关病毒（AAV）（AAV-PIB-eGFP）载体（图6A）。首先，我们观察到这三种病毒载体均能转导小鼠和人类的癌细胞系（图S10，A和B），而与AAV载体相比，Ad和LV载体的重编程效率和MHC-I表达更高（图S10，C至E）。然后，我们分析了重编程动力学，并发现在使用LV和Ad载体后第3天检测到了快速的表型变化（图S10F）。相比之下，AAV在早期时间点的重编程效率较低，未达到LV或Ad载体的效率（图S10F）。Ad介导的重编程还诱导了CD40和CD226的表达，证实了免疫原性cDC1样表型的获得（图S10，G和H）。接下来，我们比较了病毒载体穿透和转导组织的能力（图6B）。与LV（273.7 ± 26.02 mm）相比，Ad和AAV显示出更高的球体穿透能力（分别为212.0 ± 41.83和212.6 ± 18.54 mm）。在三维环境中，Ad和LV显示出最高的重编程效率（图S10I）。在患者来源的癌细胞中，在二维和三维环境中，Ad与LV在诱导cDC1重编程以及HLA-ABC和CD40表达方面相当（图6，C和D，以及图S10J）。为了评估原位肿瘤转导能力，我们向B16肿瘤连续两次瘤内注射LV-eGFP、Ad-eGFP和AAV-eGFP载体，并量化了eGFP+肿瘤细胞的比例（图6E）。我们发现，当分别给予109（2.94 ± 2.9%）和1010（2.44 ± 5.8%）病毒颗粒（VP）或8 × 1010基因组拷贝（GC）时，Ad-eGFP和AAV-eGFP显示出较高的原位转导能力（图6，F和G）。相比之下，即使在最高剂量下，LV-eGFP的转导能力也很低（0.3 ± 0.2%）（图6G）。然后，我们向两个人源异种移植模型（A2058黑素瘤和SKLMS1肉瘤）瘤内注射Ad-PIB-eGFP或对照Ad载体（Ad-Stuffer-eGFP），并检测到转导（eGFP+：SKLMS1为5.0 ± 2.7%；A2058为0.3 ± 0.2%）、原位重编程（CD45+HLA-DR+：SKLMS1为3.9 ± 0.7%；A2058为16.6 ± 2.5%）以及HLA-ABC表达增加（图6H和图S10K）。与体内所需的持久性一致，Ad载体重编程的细胞在不依赖FLT3L信号的情况下，可在体外维持至第20天（图S10L）。接下来，我们评估了诱发抗肿瘤免疫所需的剂量。估计0.06%的重编程细胞（对应于0.3%的eGFP+细胞）就足以减少肿瘤生长，并将中位生存期（MS）从25天延长至30天（图6I和图S10M）。我们观察到，0.15%和2.2%的重编程细胞分别实现了10%和100%的完全缓解（CR），这表明低剂量的cDC1就足以诱发抗肿瘤免疫。为了补充验证Ad介导的PIB递送，我们在患者来源的癌症球体中评估了抗原呈递功能，并在体内评估了抗肿瘤疗效。重编程的患者来源的黑素瘤细胞诱导了HLA匹配的CD8+ T细胞的活化和扩增，产生了效应CCR7-CD45RA-和细胞毒性CD95+CD8+ T细胞（图6J），这也导致了更多的T细胞浸润到球体中（图6，J和K）。在体内，1:1比例的Ad-PIB转导的B16细胞和亲本B16细胞减少了肿瘤生长，并延长了MS（43天对比19天；P < 0.001）（图S11A），增加了外周血中p15E特异性CD8+ T细胞的数量（图S11B），并控制了对侧肿瘤的生长（图S11C）。总体而言，这些数据表明，Ad载体结合了快速高效的重编程和原位肿瘤转导能力，为基于cDC1重编程的癌症基因治疗方法提供了一个递送平台。为了评估基于原位cDC1重编程的基因治疗方法的疗效，我们建立了B16肿瘤模型，并在第7、9、11和13天对肿瘤内注射了Ad-PIB、Ad-Stuffer或磷酸盐缓冲液（PBS），同时联合使用抗PD-1和抗CTLA-4治疗（图7A）。我们观察到，接受Ad-PIB治疗的小鼠中有50%达到了完全缓解（CR），并且在100天内无肿瘤复发（图7B）。其中两只小鼠还出现了白癜风（图S11D）。在肿瘤内部，我们检测到了CD45+细胞的富集，主要是CD8+ T细胞（图7C），这些细胞的数量与肿瘤体积呈负相关（图7D和图S11E）。Ad-PIB治疗的肿瘤中，效应T-bet+ PD-1- CD8+ T细胞增多，而终末耗竭型T-bet- PD-1+ CD8+ T细胞减少（图7E）。在Ad-PIB治疗的小鼠中，促炎CD4+ T辅助细胞与调节性T细胞（Tregs）的比例也升高，证实了基因治疗背景下向促炎反应的转变（图7F）。肿瘤内髓系细胞的频率没有变化（图S11F），但我们再次检测到PD-L1表达增加（图7G）。此外，在肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和非引流淋巴结（ndLNs）中，我们检测到了更高频率的p15E特异性CD8+ T细胞和效应记忆CD44+ CD62L- CD8+ T细胞（图7，H和I，以及图S11G）。为了测试Ad-PIB基因治疗是否能诱导免疫记忆，我们对存活的小鼠进行了皮下再次接种亲本B16细胞的挑战（图7A）。虽然未经治疗的小鼠在20天内即发展成肿瘤，但存活的小鼠在再次挑战后60天内仍无肿瘤发生（图7J）。在存活小鼠的外周血中，我们还检测到了针对黑色素瘤抗原PMEL和p15E的中枢记忆CD62L+ CD44+ CD8+ T细胞（图S11H）以及针对TRP-2、PMEL和p15E的细胞毒性效应记忆IFN-g+ CD62L- CD44+ CD8+ T细胞（图7K）。最后，我们测试了基因治疗诱导的全身性免疫记忆是否能保护小鼠免受转移性肿瘤的生长。我们利用B16细胞的转移特性，使其定殖于肺部，并在第160天通过静脉注射接种（图7A）。此前经皮下再次挑战后存活的小鼠在肺部也未形成转移灶（图7L和图S11I）。与未经治疗的小鼠相比，长期无肿瘤存活（>200天）的小鼠的血浆中自身抗体水平或内脏器官的脱靶毒性没有差异（图S12）。最终，这些结果支持了一种cDC1重编程基因治疗模式，用于癌症免疫治疗，该模式可引发全身性肿瘤抗原特异性T细胞反应，从而导致长期且安全的抗肿瘤免疫。![]()
图4. 在人类癌细胞中诱导cDC1表型。（A）评估体内表型cDC1重编程的实验设计。将人类癌细胞系用PIB-eGFP转导，植入NSG小鼠体内，并在第3、5和9天分离出来，通过流式细胞术进行表型分析。使用eGFP转导的细胞作为对照，并与体外重编程的细胞进行比较。通过流式细胞术评估重编程效率，以eGFP+转导的癌细胞中CD45+HLA-DR+细胞（完全重编程）和CD45+HLA-DR-或CD45-HLA-DR+细胞（部分重编程）的百分比表示。（B和C）胶质瘤细胞系T98G（在CD44+eGFP+细胞中圈定）和黑素瘤细胞系A375和A2058细胞（在CD44+MCSP+eGFP+细胞中圈定）的代表性流式细胞术图（B）以及体外和体内重编程动力学的定量分析（C）（n=3）。（D）T98G细胞在CD44+eGFP+细胞中以及黑素瘤A375和A2058细胞在CD44+MCSP+eGFP+细胞中，经过5天体外或体内重编程后，XCR1+（左）、CLEC9A+（中）和CD226+（右）细胞的百分比。（E）T98G细胞在CD44+eGFP+细胞中以及黑素瘤A375和A2058细胞在CD44+MCSP+eGFP+细胞中，每个细胞表面HLA-ABC分子的直方图（左）和定量分析（右）（n=3）。（F）表达CD40的细胞百分比的直方图（左）和定量分析（右）（n=3）。（C）至（F）中的数据表示3个生物学重复实验的平均值±标准差。![]()
图5. 球体和免疫抑制肿瘤环境中的重编程进展。（A）评估人类癌症球体中cDC1重编程的实验设计。将癌细胞用PIB-eGFP或PIB-mCherry转导，用于形成球体（3D）或在单层（2D）中培养。（B）用递增的感染复数（MOI）的PIB-mCherry对T98G细胞进行9天重编程后，球体微组织区域和CD45+及HLA-DR+细胞百分比的共聚焦显微镜图像和定量分析。数据表示2到10个生物学重复实验的平均值±标准差。（C）在第9天重编程时，通过流式细胞术对12个人类癌细胞系在2D和3D条件下转导的eGFP+细胞中cDC1重编程效率的定量分析。通过流式细胞术评估重编程效率，以CD45+HLA-DR+细胞（完全重编程）和CD45+HLA-DR-或CD45-HLA-DR+细胞（部分重编程）的百分比表示。数据表示4到12个生物学重复实验的平均值±标准差。（D）代表性流式细胞术图，显示2D和3D条件下重编程的T98G和A375细胞与eGFP转导细胞的表型比较。（E）在第3、7和9天重编程时，纯化重编程和部分重编程的T98G细胞，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行分析。小提琴图显示了2D和3D条件下重编程过程中内源性转录因子和cDC1基因的mRNA表达。使用eGFP转导的细胞作为第0天；供体外周血cDC1作为参考。（F）将scRNA-seq数据与已发表的树突状细胞（DC）亚群数据（GSE94820）（54）进行整合。热图显示了与各个DC亚群在转录上相关的细胞百分比。（G）热图显示了肿瘤-抗原呈递细胞（APC）基因特征激活的百分比（23）。（H）实验设计，用于评估包含T98G-eGFP+细胞的球体与指定比例的癌相关成纤维细胞（CAFs）、髓系来源抑制细胞（MDSCs）或周细胞结合时，免疫抑制对cDC1重编程的影响。（I）在球体中，随着CAFs（n=3至9，左）、MDSCs（n=3，中）和周细胞（n=6至7，右）比例的增加，T98G-eGFP+mCherry+细胞中的重编程效率。CAF07和MDSC1指来自同一个体供者的细胞。数据表示3到9个生物学重复实验的平均值±标准差。（J）球体大小作为T细胞对含有CAFs的T98G-eGFP+细胞毒性作用的指标，在与未活化的HLA-A2匹配的PBMCs共培养7天后进行评估，PBMCs预先用抗CD3和抗CD28抗体激活或用IL-2和IL-7刺激。通过成像量化eGFP+荧光区域的相对荧光单位（RFU）。数据表示14到18个生物学重复实验的平均值±标准差。（K）来自三个供者的未活化HLA-A2匹配的PBMCs与含有CAFs的T98G-eGFP+球体共培养24小时后，细胞因子释放的定量分析。数据表示9到12个生物学重复实验的平均值±标准差。（C）和（I）中的比较采用双向ANOVA分析，（J）和（K）中的比较采用单向ANOVA分析，随后进行Tukey多重比较检验。ns，无显著性；P<0.01；P<0.001；***P<0.0001。![]()
图6. 利用腺病毒（Ad）载体高效递送cDC1重编程因子。（A）实验设计，用于优先选择一种病毒载体，将PIB因子递送到肿瘤中。使用小鼠和人类癌细胞系以及患者来源的癌细胞，在单层（2D）、球体（3D）和体内肿瘤中，对慢病毒（LV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）的转导和重编程效率进行定量。（B）T98G肿瘤球体转导和渗透的光片显微镜图片（左）和定量（右），使用编码eGFP的LV、Ad和AAV载体。固定的肿瘤球体用eGFP（红色）和DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。插图（上）可视化了下方球体的3D图像构建。3D图像构建是通过成像和平面堆叠完成的。图示的轴表示成像平面的方向。使用Zeiss Arivis图像分析软件对病毒表面覆盖率和渗透率进行定量。比例尺，200毫米。数据表示2到3个生物学重复实验的平均值±标准差。（C和D）在2D或3D条件下用编码PIB的LV、Ad和AAV载体（LV-PIB-eGFP、Ad-PIB-eGFP和AAV-PIB-eGFP）转导患者来源的癌细胞9天后，重编程效率的代表性流式细胞术图（C）和定量（D）。H&N，头颈癌。数据表示2到3个生物学重复实验的平均值±标准差。（E）实验设计，用于评估C57BL/6J小鼠皮下B16肿瘤的体内转导效率。在第7天和第9天，向肿瘤注射三剂LV-eGFP、Ad-eGFP、AAV-eGFP载体或磷酸盐缓冲液（PBS），并在第12天分离进行分析。（F和G）代表性流式细胞术图，显示与PBS相比，CD45-CD44+细胞门控下Ad-eGFP的转导效率（F），以及用三种病毒载体或PBS转导的肿瘤中eGFP+细胞的定量（G）。显示了病毒颗粒（VP）的定量。数据表示9到25个生物学重复实验的平均值±标准差。（H）在NXG小鼠中建立人类SKLMS1和A2058肿瘤，并在第7、9、11和13天肿瘤内注射四次Ad-PIB-eGFP或Ad-Stuffer-eGFP，在第16天通过流式细胞术进行分析。代表性流式细胞术图（左）和eGFP+细胞门控下重编程效率的定量（右）。使用CD45+HLA-DR+群体（红色）之间的比较进行统计分析。数据表示8到10个生物学重复实验的平均值±标准差。（I）用递减剂量的PIB-eGFP转导细胞与亲本细胞系混合，建立YUMM1.7肿瘤。在转导后第9天，通过流式细胞术对平行体外培养中的细胞混合物中重编程细胞（CD45+和MHC-II+）的百分比进行定量。显示了肿瘤生长（左）和存活率（右）（n=10）。表示每组中完全缓解（CR）的小鼠数量与总小鼠数量的比例。（J）在2D条件下，用Ad-eGFP或Ad-PIB-eGFP转导的M2778细胞与（50%）或不与（100%）癌相关成纤维细胞（CAFs）共培养8天后，对CD8+T细胞数量（左）、效应细胞CCR7-CD45RA-CD8+（中）和细胞毒性CD95+CD8+T细胞（右）的百分比进行定量。（K）对球体中CD8+T细胞数量（左）、效应细胞CCR7-CD45RA-CD8+（中）和细胞毒性CD95+CD8+T细胞（右）的百分比进行定量。（J）和（K）中的数据表示3到4个生物学重复实验的平均值±标准差。（B）中的比较采用单向ANOVA分析，随后进行Dunn多重比较检验。（H）、（J）和（K）中的比较采用Mann-Whitney检验。（I）中的存活分析采用对数秩Mantel-Cox检验。ns，无显著性；P<0.01；P<0.001；***P<0.0001。![]()
图7. cDC1重编程基因治疗诱发全身性和长期抗肿瘤免疫。（A）实验设计用于评估携带皮下B16黑色素瘤肿瘤的C57BL/6J小鼠中Ad-PIB基因治疗的抗肿瘤效果。在肿瘤形成后的第7、9、11和13天，向肿瘤内注射四次Ad-PIB（红色）、非编码Ad载体对照（Ad-Stuffer，灰色）或PBS（黑色）。在第7、10和13天通过腹腔注射给予抗PD-1和抗CTLA-4（ICB）。在第100天进一步对存活小鼠皮下再次接种B16细胞，在第160天通过静脉注射再次接种。灰色框表示治疗时间。（B）肿瘤生长情况（左）和存活率（右）（n=8至10）。显示了每组完全缓解（CR）小鼠的数量占总小鼠数量的比例。（C）第16天时肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术定量。数据表示7至10个生物学重复实验的平均值±标准差。（D）CD8+T细胞浸润与肿瘤大小的相关性。（E）肿瘤内T-bet+PD-1-效应细胞、T-bet+PD-1+衰竭细胞和T-bet-PD-1-终末衰竭CD8+T细胞的百分比。使用指示的颜色编码群体之间的比较进行统计分析。（F）肿瘤内T-bet+CD44+CD4+TH细胞和CD44+CD25+Treg细胞的比例。（G）通过平均荧光强度（MFI）测量的髓系细胞中的PD-L1表达。（H）肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和非引流淋巴结（ndLNs）中肿瘤抗原p15E特异性CD8+T细胞的流式细胞术定量。（I）tdLNs中CD44+CD62L-效应记忆细胞和CD44+CD62L+中枢记忆CD8+T细胞的百分比。（E）至（I）中的数据表示6至10个生物学重复实验的平均值±标准差。（J）存活小鼠和幼稚对照小鼠皮下再次接种B16细胞。显示肿瘤生长情况（左）和存活率（右）（n=4至5）。（K）用肽TRP-2、PMEL和p15E体外再刺激后第14天，外周血中肿瘤抗原特异性T细胞的流式细胞术定量。TRP-2、PMEL和p15E特异性IFN-γ+CD44+CD62L-效应记忆CD8+T细胞的百分比。数据表示4至5个生物学重复实验的平均值±标准差。（L）存活小鼠进一步通过静脉注射再次接种B16细胞。显示再次接种后14天存活小鼠和幼稚小鼠的肺部图像（n=4）。（C）、（E）、（G）和（I）中的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Dunn多重比较检验。（H）和（K）中的比较采用Mann-Whitney U检验。（B）和（J）中的生存分析采用对数秩Mantel-Cox检验。P<0.05；P<0.01；P<0.001。在本研究中，我们证明了PU.1、IRF8和BATF3介导的肿瘤细胞命运重编程，使其在原地转化为具有免疫原性的cDC1样细胞，这是一种治疗实体瘤的新型免疫疗法。我们的研究结果表明，将PIB因子递送到原位肿瘤和肿瘤球体中，可以在表型、转录组和功能层面驱动cDC1细胞命运，从而导致肿瘤微环境（TME）重塑，诱导肿瘤特异性T细胞反应，并引发全身性和持久的抗肿瘤免疫。体内重编程导致细胞具有更成熟的表型、改善的功能和增加的保真度，这是通过与其天然对应物的分子归属来衡量的（17），即使在不构成其天然生态位的解剖位置诱导时也是如此。例如，在肝脏和肠道中重编程的b细胞也显示出更高的重编程保真度和胰岛素分泌（34, 35）。在本研究中，我们表明，在球体中和体内诱导cDC1重编程可以加速重编程并提高保真度。这可能是由于提供了体外未供应的一般组织因子或TME中可用的特定信号。已显示组织相关信号（如缺氧或力传导）可以提高诱导多能干细胞（iPSC）重编程的效率（36, 37）。缺氧和力传导通过整合素和GTP酶信号传导，增加染色质可及性和转录因子结合（36, 37）。在球体中重编程的细胞中，细胞间接触和GTP酶活性是富集的术语，这可能解释了重编程的增强。在实体瘤的TME中，缺氧和免疫抑制是抵抗免疫检查点阻断（ICB）、嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法和树突状细胞（DC）疫苗接种的驱动因素（38）。相比之下，TME衍生的信号可能有益于cDC1重编程。肿瘤还可以通过下调IRF8表达来系统性地阻断cDC1的成熟（39）。对免疫抑制不敏感可能是由于重编程过程中强制表达的IRF8补偿了外在的免疫抑制信号。先前的研究强调了cDC1在通过激活CD8+ T细胞和授权NK细胞来发挥抗肿瘤免疫中的作用（9）。尽管CD4+ T细胞的启动主要归因于cDC2，但最近的研究表明，cDC1在处理细胞相关抗原以进行MHC-II呈递和启动CD4+ T细胞方面具有更大的能力（40–42）。通过在肿瘤内补充cDC1，我们发现CD4+ T细胞是驱动肿瘤消退的多克隆扩增的关键效应细胞。CD8+ T细胞的多克隆性是接受抗PD-1阻断治疗的患者获得阳性治疗效果的要求（2）。鉴于最近描述的cDC1、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞之间的相互作用与阳性结果相关（42），很可能这些三重复合相互作用也会在TME中局部发生在重编程的癌细胞和T细胞之间，从而引发反应而无需迁移到淋巴结（LNs）。尽管在YUMM1.7肿瘤中CD4+ T细胞的重要性很明显，但其程度可能取决于肿瘤模型，因为消退的B16肿瘤显示出更高的CD8+ T细胞浸润。然而，在这两种黑色素瘤模型中，促炎CD4+ T辅助细胞与调节性T细胞（Tregs）的比例均有所增加，这意味着体内cDC1重编程可驱动强有力的CD4+ T细胞反应。除了细胞介导的免疫外，cDC1还可以协调B细胞反应和体液免疫（43）。肿瘤内B细胞也反映了三级淋巴结构（TLS）的形成，其中包含TCF-1+干细胞样T细胞、记忆T细胞和TFH细胞，这些细胞支持B细胞成熟（44）。黑色素瘤肿瘤中TLS的形成可以用作预测生存和免疫治疗反应的生物标志物（44）。我们观察到通过黑色素瘤细胞的体内重编程诱导了TLS样结构的形成，导致肿瘤内TCF-1+ T细胞、B细胞和循环TFH细胞增加。因此，体内cDC1重编程提供了一种策略，可用于在肿瘤中从头诱导TLS的形成，除了其治疗潜力外，还为研究TLS新生的机制提供了一种方法（32）。为了实现临床转化，我们测试了一种基因治疗概念，即使用非整合性病毒载体将PIB递送到肿瘤中，并在原位诱导cDC1重编程。目前，由于其高原位转导效率、安全性、大的载货空间和快速的转基因表达，仅腺病毒（Ad）载体被批准用于非裂解性肿瘤内基因治疗（45, 46）。确实，球体以及同基因和异种移植模型中的转导和重编程数据支持了Ad载体在将重编程因子递送到肿瘤细胞方面的优越性。只需产生2%的转导细胞（对应于0.15%的CD45+和MHC-II+细胞）即可诱导肿瘤生长延迟和消退，这与其他肿瘤内免疫疗法（如溶瘤病毒、自杀基因方法和共刺激分子或细胞因子的表达）相比具有显著优势，因为这些疗法需要高肿瘤细胞转导。然而，重编程的肿瘤细胞数量增加与肿瘤生长延迟和存活率提高相关，这表明原位转导效率是疗效的关键参数。本研究的一个局限性是我们尚未确定疗效是由部分或完全重编程的细胞数量决定，还是由其重编程保真度决定。未来，我们设想在Ad衣壳（47）和诸如syn-3的配方（46）中测试转导增强剂，以及使用表观遗传佐剂来提高重编程效率（48）。这些实验将有助于阐明体内重编程细胞数量与细胞质量之间的相对贡献。为了进一步开发更具可扩展性的免疫疗法，测试非病毒递送方法（如目前用于递送癌症疫苗的RNA部分（49）或已证明足以用于人类iPSC重编程的特定小分子组合（50））也将很有趣。在本研究中，我们已证明体内cDC1重编程在具有不同免疫原性、T细胞浸润、突变负荷和对ICB反应性的模型中诱导了长期且持久的肿瘤控制。尽管其作为单一疗法有效，但重要的是要注意其与ICB联合治疗免疫缺失和低免疫原性肿瘤（如B16）的协同作用。这其中的一个原因可能是肿瘤中髓系细胞上观察到的PD-L1表达增加。与ICB联合使用并未在存活小鼠中引起明显的自身免疫反应，但这可能需要在老年小鼠或易因ICB而产生自身免疫反应的模型中进行进一步探索（51）。除了与ICB联合使用外，原位cDC1重编程还可能与其他方式（如过继性T细胞）产生协同作用，通过增强靶抗原呈递和支持工程化T细胞浸润到实体肿瘤中，或给予激动性CD40抗体，考虑到CD4+ T细胞的关键作用可能依赖于CD40-CD40L相互作用，以及先前报道的在胶质瘤中诱导TLS样结构的作用（52）。由于免疫治疗的顺序已被证明会影响治疗效果（53），因此在新辅助治疗中评估这种方法在临床环境中的效果将很有趣。这可以在肿瘤切除前建立免疫能力，并支持消除残留的肿瘤细胞和转移灶。总体而言，我们提供了原则性证明，即原位cDC1重编程是一种不依赖于肿瘤起源的、现成的且个性化的免疫疗法，能够协调全身性和持久的抗肿瘤免疫。原位cDC1重编程提供了精确细胞疗法的优势，同时克服了体外细胞操作的挑战。本研究为首次人体试验铺平了道路，并为基于通过细胞重编程在体内生成的免疫细胞亚群特定功能的新型免疫疗法奠定了基础。
