慢性肾脏疾病是糖尿病发展过程中出现的并发症之一，尤其是在血糖控制不佳的情况下[1,2]。患有1型或2型糖尿病的患者中，有超过25%–40%的人在疾病发展20–35年后会患上肾病[3]。糖尿病肾病的主要临床特征包括尿白蛋白排泄量增加（≥300 mg/天）、肾小球滤过率降低以及肾功能进行性恶化，最终导致终末期肾衰竭[4]。糖尿病肾病的病理生理机制复杂，涉及众多相互关联的生化途径，这些途径主要通过相互增强而发挥作用。持续的高血糖状态会激活至少四条肾脏损伤途径：（1）生长因子合成的核激活，促进系膜细胞增殖现象[5]；（2）肾血流动力学障碍，主要激活血管收缩因子合成途径[6]；（3）炎症途径的激活，诱导趋化分子、白细胞和内皮细胞粘附分子、各种白介素的核合成因子等的合成[7]；（4）启动代谢过量葡萄糖的生化途径（多元醇、己糖胺、蛋白激酶C和糖化终产物途径）[8]。这些途径的终产物可以直接通过改变细胞通透性、产生内皮细胞功能障碍、促进细胞增殖等方式引起细胞损伤，但它们还会产生间接毒性作用，因为它们都会产生氧化应激，进而增强所有肾脏损伤机制。
氧源性自由基（氧化应激）和一氧化氮（硝化应激）的生成可直接损伤内皮细胞、足细胞和系膜细胞[9,10]；另一方面，氧源性自由基会激活炎症、促纤维化和间质生长因子生化途径[11]，从而重塑肾小球的形态和功能；它们还会刺激血管收缩介质（如血栓烷A2）的产生，并减少血管扩张介质（如前列环素）的产生[12]。鉴于氧化应激在糖尿病肾病发展中的重要性，已提出使用抗氧化剂来预防这种并发症的出现和/或发展，同时不忘血糖控制是预防糖尿病并发症的主要因素[13–15]。特级初榨橄榄油（EVOO）是一种公认的高抗氧化剂含量化合物，尤其是多酚；向慢性肾脏疾病患者施用EVOO可以改变与该病相关的几种生物标志物[16]，并且当使用高多酚含量的EVOO时，观察到肾功能生物标志物的改变更为显著[17]。
在本研究使用的糖尿病大鼠实验模型中，已证实了特级初榨橄榄油中的两种多酚——羟基酪醇和3',4'-二羟基苯乙二醇[18,19]的肾脏保护作用。最近有研究表明，特级初榨橄榄油中的三萜类化合物可能对多种心血管疾病有益[20]，因此，我们提出了本研究，以试图探究这些衍生物对糖尿病肾病的可能影响。
本研究的目的是评估与另一种具有相同多酚含量但三萜类化合物浓度较低的橄榄油相比，高三萜类化合物含量的橄榄油在糖尿病实验模型中对氧化应激和硝化应激以及肾功能和形态的各种生物标志物的可能影响。
2，材料与方法
2.1. 分析试剂
比色试剂盒：硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、总抗氧化能力（TAC）（Cell Biolabs Inc.，Bionova Científica S.L.，马德里，西班牙）和还原型谷胱甘肽（Abcam，剑桥，英国）。酶免疫测定试剂盒：3-硝基酪氨酸、8-异前列腺素F2α（8-异前列烷）、8-羟基-2-脱氧鸟苷（Cell Biolabs Inc.，Bionova Científica S.L.，马德里，西班牙）、11-脱氢血栓烷B2和6-酮-前列腺素F1α（Cayman Chemical Co.，安阿伯，密歇根州，美国）。其余所用试剂购自Sigma Chemical Corp.（圣路易斯，密苏里州，美国）。
2.2. 橄榄果实衍生产品
使用了两种油，均为Picual品种的橄榄油，由Emilio Vallejo S.A.（Torredonjimeno，哈恩，西班牙）生产和加工。Picual品种橄榄的采摘程序如下：
去核橄榄油（DOO）
由Picual品种橄榄去核后，采用两阶段冷提取系统进行加工处理[21]。该过程包括分离叶子和枝条、研磨、击打、压榨所得浆料、用水洗涤、倾析以及获得最终橄榄油。此程序在Emilio Vallejo S.A.（Torredonjimeno，哈恩）进行。
去核脱水橄榄油（DDOO）
为获得此油，将橄榄清洗、去核，然后在不超过40°C的温度下脱水。最后，对脱水后的果浆进行连续离心以获得最终油品。该程序由Olmo-García等人描述[22]。该过程包括以下步骤：（a）获得橄榄果浆；（b）橄榄果浆脱水，得到脱水橄榄果浆；（c）脱水橄榄果浆研磨，得到干脱水橄榄粉；（d）从干脱水橄榄粉中获得橄榄油。
此程序在Acer Camprestres S.L.（Castillo de Locubin，哈恩，西班牙）进行。
表1显示了给予实验动物的两种油的成分。采用同时提取油和脂肪酸甲酯化法分析油的脂肪酸组成。使用PerkinElmer Clarus 600 GC气相色谱仪（PerkinElmer Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）。气相色谱仪配备有BPX70 30 m × 0.25 mm内径 × 0.25 µm膜厚的毛细管柱（SGE Analytical Science Pty，Ltd.，林伍德，澳大利亚）。分流注射器和火焰离子化检测器保持在300°C；使用氢气作为载气（0.8 mL/min）。脂肪醇、甾醇和三萜二醇（红花醇和乌瓦醇）的测定在配备有FID检测器的Agilent 7890A气相色谱系统（Agilent Technologies，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国）上进行。分析柱为HP-5（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷柱（30 m × 0.32 mm内径，0.25 µm膜厚）。
2.3.1 研究设计、动物护理与样本量
本研究于马拉加大学实验中心（CECA）进行。当动物体重达到250-270克时，被纳入研究，并在CECA接受为期一周的检疫。之后，对它们进行单独标识，并单独饲养至随访期结束，期间提供充足的食物和水，并记录动物每天的饮水量和饲料消耗量。
本研究遵循《赫尔辛基宣言》和《生物医学研究法》（第14/2007号法律）的指导原则，并获得了马拉加大学实验伦理委员会（编号：CEUMA31-2018-A）和安达卢西亚自治区农业、畜牧业、渔业和可持续发展委员会（编号：9/07/2019/124）的批准。
在整个实验过程中，动物的使用均符合西班牙当前关于动物护理、使用和饲养的法规（EDL 2013/80847, BOE-A-2013-6271），并遵循《实验室动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院出版物第86-23号，1985年修订）的建议，以及西班牙动物保护法的相关规定。
在实验初期及整个实验发展过程中，均遵循了动物实验中必须遵守的3R原则：
替代（Replacement）：开发1型糖尿病实验模型，能够复现糖尿病患者中出现的宏观和微观血管病变，从而评估血管、大脑、肾脏和视网膜损伤的多种生物标志物，确定潜在的治疗靶点。这需要一个活体生物体，其中所有受慢性高血糖影响的器官系统都相互关联，而这一目标无法在体外模型中实现。
减少（Reduction）：根据治疗糖尿病动物与未治疗动物相比，在定义糖尿病肾病的主要参数（蛋白尿和肾小球体积）上的差异百分比，计算样本量，两个参数的减少百分比均设定为30%。每组动物数量为10只，包括10%的替换率。
精炼（Refinement）：所有动物均由具有丰富动物处理经验和官方认证的实验动物处理人员操作，始终减少所用程序可能产生的痛苦，并尽量减少动物操作次数。另一种减轻动物压力的方法是优化实验环境。在实验过程中，动物被放置在保温毯上以保持最佳体温，并尽量减少噪音来源。在治疗期结束时，动物接受戊巴比妥钠麻醉，在确保动物对外界刺激无反应后，进行放血并摘取研究所需的器官。随后，由于这是一项不可恢复性程序，根据此类实验的协议，使用断头器对动物进行断头处理。
每日检查实验动物是否出现以下体征和症状：
出现呼吸困难、出血、昏迷或恶病质视为终点标准。
出现异常或分泌物增多（无=0分；有=1分）；与同类或研究人员隔离或表现出攻击性态度（无=0分；有=1分）；腹泻（无=0分；有=1分）。若达到2分，则应用终点标准。
实验过程中无动物死亡，也无需应用终点标准。
2.3.2 研究组、纳入与排除标准以及随机化
在马拉加大学动物实验中心的兽医确认实验动物健康后，将它们随机分配到四个组，按以下顺序连续纳入（每组n=10只大鼠）：
正常血糖对照组（NCR）：在这些动物中，每次操作均给予等渗盐水，而其他动物则需要给予某种试剂或研究化合物。
糖尿病对照组（DCR）：这些动物按以下部分所述方法诱导产生糖尿病，给予盐水而非研究用油，并皮下注射3-4单位的半慢效胰岛素（Levemir®，诺和诺德公司，丹麦巴格斯瓦德），以降低因过度高血糖导致死亡的可能性。
给予去石橄榄油（DOO）治疗的糖尿病动物组，剂量为0.5 mL/kg/天，口服。
给予去石脱水橄榄油（DDOO）治疗的糖尿病动物组，剂量为0.5 mL/kg/天，口服。
采用简单随机化系统将动物分配到各研究组，不使用随机化表，而是由团队成员随机选择每只动物，并按顺序连续纳入以下组别：（1）健康对照组，（2）糖尿病对照组，（3）DOO治疗的糖尿病组，以及（4）DDOO治疗的糖尿病组。
所有动物均单独饲养在带有编码的笼子中，该编码记录在工作簿和动物实验中心的计算机数据库中。健康对照组的盐水、胰岛素以及两种研究用油（用于糖尿病大鼠）的给药均由研究团队中的两名固定成员执行，他们通过笼子和工作簿上的编码确认每只动物的身份。
在所有情况下，随访期均为两个月，对照组中油或盐水的给药通过口胃管插管进行，每日一次，于上午9:00给药。油的给药剂量是基于人类研究中特级初榨橄榄油的给药剂量（40-50 mL/天，相当于体重75-80公斤的人每天0.5 mL/kg）进行调整的。
通过单次腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素诱导糖尿病。这种实验方法被公认为可有效诱导大鼠产生类似人类1型糖尿病的糖尿病。当连续两天通过尾静脉采血测得血糖值均大于200 mg/dL时（使用FreeStyle血糖仪，艾伯特实验室S.A.，西班牙马德里），即认为动物患有糖尿病。
2.3.3 分析技术
本研究中对所有动物均进行了所有分析技术的检测，因此每个实验组均有10个不同样本进行各项分析测定。无任何样本被排除，所有样本均用于结果分析。
样本
在第58天，使用代谢笼（Tecniplast S.p.A.，Buguggiate，意大利）收集24小时尿液。样本在4°C下以3500×g离心10分钟，分装后于-80°C冷冻保存。
在第60天随访时，动物禁食12小时后，使用戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）进行麻醉，并从髂动脉分叉处采血。随后，灌注37°C的等渗盐水溶液。动物处死后，获取以下生物样本：
非抗凝血液以3500×g离心以获取血清，分装后于-80°C冷冻保存。
肾组织。右肾用于后续组织学分析，左肾用于测定生化指标。左肾的肾皮质在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0，1/15 w/v）中均质化，然后在4°C下以13,000×g离心15分钟。上清液分装后于-80°C冷冻保存。
如上所述的24小时尿液。
血清和尿液中生化指标的测定
使用Siemens Healthineers（Erlangen，德国）的Atellica®CH自动分析仪进行分析。肌酐清除率根据以下标准公式[23]计算：
肌酐清除率 = 尿肌酐（mg/dL）× 尿量（mL）/血清肌酐（mg/dL）× 1000/体重（g）× 1/1440。
氧化应激和硝化应激
作为血清和肾组织中脂质过氧化物浓度的指标，通过量化与硫代巴比妥酸反应的物质来测定，因为丙二醛是该反应的主要产物。我们通过测定尿8-异前列腺烷浓度来全面量化氧化应激[24]。作为氧化应激诱导的DNA损伤指标，测定了8-羟基-2-脱氧鸟苷。使用血清和肾谷胱甘肽浓度、谷胱甘肽过氧化物酶活性以及总抗氧化能力来评估抗氧化防御能力。作为硝化应激（过氧亚硝基形成）的指标，我们测定了血清和肾组织中3-硝基酪氨酸的浓度。所有这些参数均根据制造商的协议进行测定。
尿前列腺素类
根据制造商的协议，通过测定其主要代谢产物11-脱氢血栓烷B2和6-酮-前列腺素F1α的尿浓度来量化血栓烷和前列环素的产生。
形态学分析
肾脏用10%福尔马林固定，切成5 µm厚的切片，并根据常规实验室方法用苏木精和伊红以及过碘酸雪夫（PAS）染色。使用图像分析系统（Olympus BX-UCB，配备VS-ASW FL软件，Olympus，Hamburg，Germany）分析染色切片。使用QuPach-0程序和FIJI ImageJ程序（https://imagej.net/，访问日期：2023年10月3日）进行定量分析。根据Lane等人[25]的方法计算肾小球体积（GV）：
GV = (GA)3/2 × β/d
其中GA为肾小球面积，β为无量纲的形状系数（对于完美球体，β = 1.0），d为调整肾小球大小变化的尺寸分布系数。
为了计算肾小球硬化率（GMR），使用了PAS染色的切片（每切片50个肾小球）。在评估每个肾小球面积后，使用以下公式通过图像分析量化PAS阳性表面积：
[PAS(+)A (µm2)/GA (µm2)] × 100
其中GMR为PAS(+)染色表面积占肾小球面积的百分比；PAS(+)A：肾小球中PAS(+)物质占据的面积；GA：肾小球面积。
2.4 统计学分析
单变量分析：文中、表格和图表中的数据表示每组10只动物的平均值±标准差。所有统计分析均使用授权给马拉加大学中央计算机服务中心的社会科学统计软件包29.0版（SPSS Co.，Chicago，IL，USA）进行。双变量分析采用ANOVA，并随后进行Bonferroni变换，以评估不同治疗组之间的差异。使用非配对数据的Student’s t检验来确定非糖尿病对照组与糖尿病对照组之间分析变量的差异。通过计算Pearson相关系数来建立生化-形态学相关性。统计显著性以p值小于0.05为准。
3，结果
3.1. 动物形态学变量
糖尿病动物的体重增加显著低于非糖尿病动物。接受两种油类治疗的糖尿病动物的体重增加显著高于糖尿病对照组。糖尿病动物的肾脏重量高出66%，而接受两种油类治疗的动物肾脏重量增加了33%（表2）。
糖尿病动物的食物摄入量比血糖正常动物少34%，而饮水量则是血糖正常动物的3.4倍。两种油类均显著增加了食物摄入量，并显著减少了饮水量，尽管仍未达到健康动物的水平（表2）。
3.2. 血清和尿液生物化学指标
糖尿病模型的诱导显著升高了血糖水平，而在接受去核脱水橄榄油治疗的动物中，血糖水平有所降低，尽管与健康动物相比，血糖水平仍然显著升高。尿液中的葡萄糖值也观察到了相同的趋势（表3）。
表3. 对照组健康大鼠、对照组糖尿病大鼠以及接受每天0.5 mL/kg口服去核橄榄油和去核脱水橄榄油治疗的糖尿病大鼠，在两个月随访后的生物化学变量（平均值±标准差）。每组n=10只大鼠。
糖尿病对照组动物的血清肌酐水平显著高于健康对照组（高出66%），而尿肌酐则降低了41.5%。两种油类的给药均使血清肌酐水平降低了20%，并使尿肌酐浓度分别提高了17%（去核橄榄油）和27%（去核脱水橄榄油）（表3）。
在所有研究组中，血清蛋白水平均未观察到统计学显著差异，然而尿蛋白浓度显著增加，经去核橄榄油治疗后降低了43.5%，而去核脱水橄榄油治疗则降低了81%（表3）。
糖尿病对照组动物的血脂特征为血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯水平显著升高，而血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度降低。两种油类的给药均显著降低了升高的参数，并提高了HDL-C的水平；除了对HDL-C浓度的影响外，去核脱水橄榄油的给药效果显著高于去核橄榄油（表3）。
糖尿病对照组动物的尿前列腺素排泄量存在显著差异，其中血栓烷代谢物高出2.8倍，而前列环素代谢物则降低了62%。两种油类的给药均减少了血栓烷代谢物的排泄，并增加了前列环素代谢物的排泄，其中去核脱水橄榄油的给药使这些值恢复正常（表3）。
3.3. 肾脏变量
与尿肌酐浓度相关的尿蛋白排泄量在糖尿病对照组动物中显著增加，而在接受两种油类治疗的糖尿病动物中，这一比例有所降低，尽管接受去核脱水橄榄油治疗的动物显示出显著降低的值（与去核橄榄油相比，降低75.5% vs 62.5%）（图1）。
图1. 健康大鼠、对照糖尿病大鼠以及接受每天0.5 mL/kg口服去核橄榄油（DOO）或去核脱水橄榄油（DDOO）治疗的糖尿病大鼠的生化（尿蛋白/肌酐比和肌酐清除率）和形态学（肾小球体积和肾小球硬化指数）肾脏变量的平均值（平均值±标准差）。每组n=10只大鼠。*表示与健康大鼠相比p<0.05，+表示与对照糖尿病大鼠相比p<0.05，a表示与去核橄榄油组相比p<0.05。
糖尿病对照组动物的肾脏肌酐清除率降低了52%，而去核橄榄油给药后增加了12.3%，去核脱水橄榄油给药后增加了21.9%（图1）。
对肾脏样本的形态学分析显示，肾小球体积显著增加了2.1倍，肾小球硬化指数显著增加了10倍。两种油均降低了这两个参数：去核橄榄油使肾小球体积降低了31%，肾小球硬化指数降低了61%；去核脱水橄榄油使肾小球体积降低了40%，肾小球硬化指数降低了68%（图1）。图2和图3展示了一些这些组织学测定的代表性示例。
图2. 健康大鼠、对照糖尿病大鼠以及接受每天0.5 mL/kg口服去核橄榄油（DOO）或去核脱水橄榄油（DDOO）治疗的糖尿病大鼠的肾小球图像代表性示例。染色：苏木精-伊红（X20）。此染色显示，糖尿病对照组动物的肾小球比其他组更大，而DOO和DDOO治疗可减小肾小球面积，但未达到健康对照组动物肾小球的大小。
图3. 健康大鼠、对照糖尿病大鼠以及接受每天0.5 mL/kg口服去核橄榄油（DOO）或去核脱水橄榄油（DDOO）治疗的糖尿病大鼠的PAS染色肾小球（X20）代表性示例。这些图像显示，对照糖尿病大鼠的系膜扩张，并积累了PAS阳性物质。
3.4. 氧化应激和硝化应激
糖尿病对照组动物在所有与氧化应激和硝化应激相关的变量上均显示出显著增加，这表明氧化过程过度且抗氧化防御参数降低，无论是在血清样本还是肾脏组织样本中均如此。去核橄榄油的给药降低了血清和肾脏中的氧化应激和硝化应激。去核脱水橄榄油的给药也降低了氧化应激和硝化应激变量的浓度，并且在除肾脏组织总抗氧化能力以外的所有变量上，其效果均显著优于去核橄榄油。
表4. 对照健康大鼠、对照糖尿病大鼠以及接受每天0.5 mL/kg口服去核橄榄油和去核脱水橄榄油治疗的糖尿病大鼠，在两个月随访后的氧化应激变量（平均值±标准差）。每组n=10只大鼠。
3.5. 相关性分析
肾脏变量（如尿蛋白/肌酐比、肌酐清除率、肾小球体积和肾小球硬化指数）与血清和肾脏中的氧化应激、硝化应激以及前列腺素类物质生成之间存在统计学上的相关性（表5）。
表5. 肾功能变量与分析的生物化学变量之间的皮尔逊相关系数
4，讨论
本研究结果表明，在去核且脱水的橄榄油（该油富含三萜类化合物，且总多酚含量与去核橄榄油相等）给药后，在类似人类1型糖尿病的实验性糖尿病模型中，展现出了更强的肾脏保护作用和抗氧化作用。
鉴于自由基和氧化应激在糖尿病慢性肾脏疾病发展和演变中的重要性，已提出将抗氧化化合物的给药作为一种干预手段，以辅助严格血糖控制对延缓和/或预防糖尿病宏观和微观血管并发症的作用[26]。本研究获得的结果显示，在所使用的实验模型中，无论是系统性（血清检测）还是肾脏组织本身，都存在明显的氧化应激（表4），从而证实了这一重要的病理生理方面。同样，肾脏损伤变量（形态学和功能性）与定义系统性及肾脏氧化应激的变量之间存在统计学上的显著关系（表5）。
多项研究证明了某些天然抗氧化剂在预防慢性肾脏疾病方面的作用，主要集中在膳食多酚的组成上。一些多酚已在实验性缺血-再灌注模型中显示出肾脏保护作用，这与其抗氧化和抗炎作用有关，如白藜芦醇、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、鞣花酸、姜黄素等。一些多酚在糖尿病肾病模型中也显示出保护作用，如白藜芦醇[27]、多糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、表儿茶素、奥利戈诺等[28]。
关于特级初榨橄榄油中的多酚，作为地中海饮食的一部分，已有研究表明，橄榄苦苷以及羟基酪醇和3',4'-二羟基苯乙二醇在本研究使用的相同实验模型中具有肾脏保护作用，这始终与其抗氧化能力有关[18,19,29]。特级初榨橄榄油中存在的其他化合物是三萜类化合物，如齐墩果酸和马斯林酸，这两种化合物在实验性糖尿病模型中具有重要的抗氧化和肾脏保护作用，可能是通过激活NRF2途径实现的[30]。
我们不能排除这样一种观点：在特级初榨橄榄油中，所有这些多酚都存在并可能在它们之间产生协同作用，正如羟基酪醇和3',4'-二羟基苯乙二醇在实验性1型糖尿病中对心血管生物标志物和神经保护[31,32]以及血小板聚集[33]方面所展示的那样。因此，为了研究饮食中三萜类化合物的可能作用，必须考虑特级初榨橄榄油中存在的其他多酚的作用，这就是为什么我们使用了一种含有相同总酒精多酚含量的橄榄油（其肾脏保护作用已得到证实），但其中一种橄榄油（去核脱水橄榄油）富含三萜类化合物的原因。
首先，应该注意的是，在实验性糖尿病模型中，对非肾脏生物标志物也有影响，这可能会影响糖尿病肾病的发展，如高脂血症状态（表3）或系统性氧化应激（表4）；在这两种情况下，去核脱水橄榄油（DDOO）的效果均优于去核橄榄油（DOO）。也就是说，尽管酒精多酚在这一层面产生了有益效果，但三萜类衍生物的存在增强了这种效果。关于羟基酪醇的降脂作用的研究涉及2型糖尿病模型[34]，而齐墩果酸的研究在1型糖尿病模型中显示出降脂作用[35]，正如我们在本研究中所展示的那样。
关于抗氧化作用，已知如羟基酪醇等酒精多酚在糖尿病模型中以及大脑、肾脏等各个器官以及血液血清的系统层面上都具有明显的抗氧化作用[19,36]。关于三萜类衍生物，一项在健康志愿者中进行的研究显示，与三萜类含量较低的特级初榨橄榄油相比，富含齐墩果酸和马斯林酸的特级初榨橄榄油在促进8-异前列烷和8-羟基-2'-脱氧鸟苷的尿排泄方面效果更强[37]。这项研究与我们在糖尿病实验模型中获得的抗氧化作用结果相一致。齐墩果酸和马斯林酸的抗氧化作用与大脑和心脏层面的抗炎和细胞保护作用有关[38-41]。
考虑到氧化应激在糖尿病肾病发展中的重要性，由于本研究中使用的橄榄油含有酒精多酚，因此应能改善糖尿病动物的肾功能；而去核脱水橄榄油由于其三萜类化合物含量更高，因此应在这一层面产生更强的作用。确实，接受去核橄榄油治疗的动物降低了表明糖尿病动物肾脏形态和功能损伤的变量，而接受去核脱水橄榄油治疗的动物的这种肾脏保护作用更为显著（表3和图1）。
此外，还观察到血栓烷/前列环素比例失衡，偏向于血管收缩化合物，这一事实也可能参与糖尿病肾病的发展。去核橄榄油的给药减少了血栓烷代谢物的尿排泄，并减轻了对前列环素产生的抑制作用，这一作用在三萜类化合物丰富的橄榄油组中更为显著。羟基酪醇已显示出对环氧合酶的抑制作用，从而减少血小板和肾脏血栓烷的产生，其抗氧化作用减少了自由基对前列环素的降解[36]。关于三萜类化合物，已有研究表明，齐墩果酸通过与2型环氧合酶相关的机制诱导血管平滑肌细胞培养物中的前列环素产生[42]，而马斯林酸抑制血小板血栓烷诱导的血小板聚集[43]。
最后，这些机制的重要性体现在肾脏损伤主要变量与研究的其他生化变量之间存在相关性（表5），这一事实已在羟基酪醇和3',4'-二羟基苯乙二醇的研究中得到证实[18,19]。
尽管取得了这些结果，但本研究仍存在一些局限性。首先，我们专注于解释去核脱水橄榄油由于三萜类化合物含量更高而具有的更强肾脏保护作用，因为去核橄榄油也显示出肾脏保护作用，但程度较轻。这些结果并不表明三萜类化合物是肾脏保护作用的唯一原因，因为如上所述，酒精多酚已经证明了这种作用；然而，不能排除特级初榨橄榄油中的其他化合物也可能具有肾脏保护作用，尽管这一点在文献中尚未有报道。本研究在这一层面的主要局限性是，我们未单独或组合使用这些化合物进行实验，因此我们必须假设三萜类化合物与其余多酚通过添加或增强机制共同发挥肾脏保护作用。未来需要对酒精多酚和三萜类化合物进行关联研究，以评估它们之间可能存在的正向相互作用，以及三萜类化合物在糖尿病肾病机制中的真正作用。本研究的另一个局限性是使用了简单的随机化系统，而未使用人类研究中常用的随机化生成系统。此外，本研究是在类似人类1型糖尿病的实验模型中进行的，因此未来需要在2型糖尿病实验模型中进行研究。这两种类型的研究目前在我们实验室均处于早期阶段。
5，结论
在特级初榨橄榄油中存在的其余多酚的基础上，给予富含三萜类化合物的橄榄油在1型糖尿病实验模型中显示出更强的肾脏保护作用，这种作用与抗氧化机制以及对血栓烷和前列环素等前列腺素的影响有关。
