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正文
乌梢蛇是一味治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的常用中药，乌梢蛇水解液能缓解胶原关节炎大鼠的关节炎症并含有丰富的胶原蛋白,为了探索其治疗类风湿性关节疾病的机制，对乌梢蛇Ⅱ型胶原进行了提取和纯化，初步研究发现乌梢蛇Ⅱ型胶原具有与牛Ⅱ型胶原相似的抗原性和致关节炎特性2,本实验以胶原诱导的关节炎大鼠为实验模型，比较蛇Ⅱ型胶原和牛Ⅱ型胶原对肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10等细胞因子和淋巴细胞亚群的影响，观察乌梢蛇Ⅱ型胶原对关节炎大鼠的免疫调节作用，现将结果报告如下。
1材料和方法
1.1实验动物
活乌梢蛇，长1.5~2 m,由本院制剂室提供；SD大鼠，体质量(100±5)g,雄性，购自浙江大学医学院实验动物中心，并于该动物中心动物清洁级饲养。
1.2 试剂和仪器
牛Ⅱ型胶原标准品(Sigma公司),小鼠抗Ⅱ型胶原单克隆抗体(美国Chemicon公司),抗小鼠IgG酶标抗体(美国Chemicon公司),IL-1、L-4、IL-10、TNF-α等细胞因子酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均为R&D公司产品，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠CD4、藻红蛋白(PE)标记的CD8单克隆抗体、溶血素购自美国Caltag公司，硝酸纤维素膜(Millipore),DEAE-52纤维素(Sigma);电泳仪(BIORAD),低温高速离心(美国贺利氏),冷冻干燥系统(美国SAVANT),蛋白纯化系统(美国Phamacia),流式细胞仪(BD-LSR,Backman),紫外分光光度计(BECKMAN)。
1.3 乌梢蛇Ⅱ型胶原纯化和鉴定
乌梢蛇冻干燥后粉碎成蛇粉，胃蛋白酶消化、乙酸溶解，多次低温高速离心分离后，经DEAE-52纤维素交换柱纯化，提纯物经SDS-PAGE凝胶电泳法、经抗Ⅱ型胶原单克隆抗体的斑点免疫渗滤试验和免疫印迹试验进行鉴定，并以牛Ⅱ型胶原标准品对照，确认为Ⅱ型胶原。
1.4 Ⅱ型胶原关节炎诱导方法及评价标准:
诱导组：在乙醚麻醉下，大鼠每只背部皮下多点位注射牛Ⅱ型胶原不完全佐剂0.8 ml,两后足垫皮下各0.1 ml;首次免疫7d后，大鼠两后足垫皮下再次注射，继续饲养至15 d后观察各组动物关节炎的发病情况。对照组：不完全佐剂加等体积醋酸溶液稀释后背部皮下多点位注射作对照。四肢及足关节评分标准如下：0分：无红肿；1分：个别足趾轻度红肿；2分：数个足趾及足掌红肿；3分：踝关节以下足掌严重红肿；4分：红肿超过踝关节。每个肢体分别评分，各肢体分数之和即为该鼠的关节炎指数。
1.5 Ⅱ型胶原口服方法：
在首次免疫15 d后，将表现关节炎的大鼠随机分成3组，乌梢蛇Ⅱ型胶原组：灌胃乌梢蛇Ⅱ型胶原溶液1 ml(内含胶原15 mg/kg);牛Ⅱ型胶原组：灌胃牛Ⅱ型胶原溶液1 ml(内含胶原15mg/kg);关节炎对照组：灌胃不含胶原的胶原稀释液1 ml,3组灌胃均每日1次，连续灌胃至15 d。另设健康对照组：灌胃不含胶原的胶原稀释液1 ml。4组灌胃均每日1次，连续灌胃至15 d。
本研究用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠产生的关节炎为动物模型，患病大鼠出现明显的关节炎表现，体内有自身免疫应答反应出现，外周血中可测得抗Ⅱ型胶原自身抗体、TNF-α水平升高和IL-10水平下降以及CD4*T细胞比例升高。关节炎大鼠经口服乌梢蛇Ⅱ型胶原或牛Ⅱ型胶原后，TNF-α水平和CD4*T淋巴细胞百分比恢复至正常范围、IL-10水平得到部分升高和抗Ⅱ型胶原自身抗体滴度有所下降，提示乌梢蛇Ⅱ型胶原与牛Ⅱ型胶原具有相似的免疫调节作用，蛇Ⅱ型胶原具有使关节炎大鼠产生对Ⅱ型胶原产生免疫耐受的作用。免疫耐受治疗RA是近来的研究热点，其产生的机制相当复杂，旁观者抑制作用(bystander suppresion)的理论认为肠道T细胞在接触耐受原后，活化形成抑制性T细胞(主要是Th2细胞),这些活化的T细胞通过血循环到达病变的关节处，与暴露的Ⅱ型胶原接触后被激活，分泌抑制性细胞因子，从而抑制局部的炎症反应14.5。
Ⅱ型胶原由3个相同的α1(Ⅱ)链构成的同型三聚体，每一条α氨基酸序列在不同种系间具有高度的保守性，水解片段抗原性及其氨基酸组成分析表明，具有免疫应答的免疫原性决定簇主要集中在260~270氨基酸，次要的决定簇在286~300氨基酸，人工合成含有263~270氨基酸组成的多肽片段能诱导动物产生关节炎，体外能激活RA患者特异性T细胞并分泌相应的细胞因子6。乌梢蛇作为治疗风湿关节疾病的常用中药，应用于风湿痹症的治疗在我国已有悠久历史，乌梢蛇制剂治疗RA随机双盲安慰剂对照临床试验显示有效率达64%7,乌梢蛇治疗RA的机制可能与所含的Ⅱ型胶原有关。乌梢蛇Ⅱ型胶原不仅能与抗牛Ⅱ型胶原存在着相同的抗原决定簇2,而且具有与牛Ⅱ型胶原相似的诱导免疫耐受能力，但乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白的抗原性和氨基酸组成分析未见报道，作为爬行动物蛇Ⅱ型胶原的抗原性与哺乳动物Ⅱ型胶原抗原性是否存在着某些差异，从而更有效地诱导免疫耐受形成，因此阐明乌梢蛇Ⅱ型胶原抗原区域的氨基酸组成，寻找有效治疗RA的免疫耐受多肽是进一步研究的方向。
