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摘要
本研究旨在探讨富含多糖的乌梅果汁浓缩物（PFC）对慢性肾脏病（CKD）小鼠尿酸（UA）排泄和肠道微生物群的影响。C57BL/6小鼠被随机分为四组：两组喂食AIN93M饲料，其中一组给予500 mg/kg的PFC；另外两组喂食含有0.2%腺嘌呤的AIN93M饲料，其中一组同样给予500 mg/kg的PFC。研究发现，PFC促进了尿酸的排泄，这一作用可能是通过增加CKD小鼠肾脏中ATP结合盒转运体G2（ABCG2）、有机阴离子转运体1（OAT1）、有机肉碱转运体2（OCTN2）的蛋白质表达，以及降低葡萄糖转运体9（GLUT9）和尿酸转运体1（URAT1）的蛋白质表达来实现的。PFC的给药还增加了肠道中ABCG2的表达。此外，PFC显著提高了大肠中短链脂肪酸（SCFAs）的浓度和肠道微生物物种的数量，并降低了对尿酸排泄有负面影响的菌属（如拟杆菌属、假黄酮菌属、幽门螺杆菌属、梭菌属IV和另枝菌属）的丰度。综上所述，PFC可能通过改变尿酸转运体的表达和调节肠道微生物群来促进CKD小鼠的尿酸排泄。
尿酸（UA）是人体中嘌呤核苷经黄嘌呤脱氢酶代谢的最终产物（Yun等，2017）。肾脏和肠道负责调节尿酸，尿酸的过度产生或排泄不良会导致血清尿酸浓度升高（Abou-Elela，2017；Singh，2019；Zhao等，2012）。因此，高尿酸浓度在慢性肾脏病（CKD）中很常见。既往研究表明，高尿酸浓度和高腺嘌呤饮食是CKD的风险因素（Nashar和Fried，2012；Zhu等，2014），且降尿酸治疗可使CKD的相对风险降低55%（Su等，2017）。血清尿酸浓度主要受肾脏和肠道排泄的控制，这一过程是通过尿酸转运体介导的（Hosomi等，2012；Ichida等，2012）。大约60%–70%的尿酸通过肾脏尿酸转运体排泄，包括ATP结合盒转运体G2（ABCG2）、有机阴离子转运体1（OAT1）、有机肉碱转运体2（OCTN2）、葡萄糖转运体9（GLUT9）和尿酸转运体1（URAT1）（Bhatnagar等，2016；Huo和Liu，2018；Zhang等，2018）。剩余的30%–40%的尿酸被认为主要通过ABCG2排入肠腔（Hosomi等，2012）。事实上，肠道中ABCG2的表达水平高于肾脏（Kumagai等，2017）。综上所述，这些研究表明肾脏和肠道尿酸转运体对尿酸排泄至关重要。饮食在CKD的发展中起着重要作用。流行病学研究表明，富含腺嘌呤的饮食会增加CKD的风险（Hou等，2020；Metzger等，2020；Yang等，2018），并且对肠道微生物群有显著影响，从而影响宿主的代谢。近年来，肠道微生物失调已被确定为CKD并发症的一个主要新型风险因素（Chen等，2022；Mishima等，2017；Ruiz-Andres等，2016）。研究表明，特定细菌类群（如拟杆菌属和乳杆菌属）的丰度可能影响肠道中代谢产物（如短链脂肪酸（SCFAs）和毒素）的浓度，这些代谢产物可能使人易患CKD（Castillo-Rodriguez等，2018）。此外，喂食腺嘌呤饮食会影响CKD小鼠的肠道微生物群，进而改变代谢产物的浓度，这些变化会影响尿酸转运体的表达（Mishima等，2017）。因此，肠道微生物群可能参与特定物质改善CKD的机制。近年来，多糖在高尿酸血症的治疗中显示出良好前景。从金银花中获得的水溶性多糖可显著降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平（Yang等，2019）。蛹虫草产生的胞外多糖在400 mg/kg的剂量下对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症表现出明显的降尿酸能力（Ma等，2014）。此外，膳食多糖可调节糖尿病小鼠和环磷酰胺处理小鼠的肠道微生物群（Ding等，2019；Wang等，2020）。乌梅是一种天然植物，因其高观赏价值（色彩丰富的花冠、宜人的香气、垂枝特性）以及果实的烹饪、营养和药用潜力，在日本（称为ume）、中国东南部（称为m´ei）和韩国（称为maesil）被广泛栽培。乌梅果实的提取物也已在许多烹饪和药用制剂中长期使用（Bailly，2020）。既往研究表明，乌梅果实的甲醇提取物可降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸浓度（Yi等，2012），乌梅果实的乙醇提取物可通过调节C2C12肌管中的PPAR-c来刺激葡萄糖摄取，并改善高脂饮食喂养小鼠的葡萄糖不耐受和脂肪积累（Shin等，2013），乌梅果实的浓缩水提取物可抑制3T3-L1脂肪细胞中的脂肪生成（Bu等，2021）。研究还报道，乌梅叶提取物可降低糖尿病小鼠的血糖水平（Lee等，2016），乌梅籽提取物可预防氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症（Xia等，2013a）。富含多糖的乌梅果汁浓缩物（PFC）是一种日本传统产品，可改善血液循环（Utsunomiya等，2002）和免疫力（Lee等，2017），并减轻疲劳（Sriwilaijaroen等，2011）。它是由新鲜果实经长时间煮沸后反复浓缩制成的。PFC中多糖的含量约为75.30%。既往研究报道，多糖的数均分子量和重均分子量分别为1.60 kDa和1.68 kDa，主要单糖为半乳糖（41.49%）、葡萄糖（36.45%）、阿拉伯糖（9.14%）、甘露糖（4.92%）、核糖（4.34%）和木糖（3.23%）（Xiang等，2020）。然而，迄今为止，在CKD模型中尚未研究PFC对尿酸排泄和肠道微生物群的影响。因此，本研究旨在探讨PFC对腺嘌呤饮食诱导的CKD小鼠的影响。为此，我们测量了尿酸排泄量、尿酸转运体表达量和大肠短链脂肪酸浓度，并通过16S rDNA测序确定了PFC对肠道微生物群的影响。本研究的结果可能为含PFC的功能性食品的开发和使用提供指导。PFC（批号：20161215）购自日本Sunactis公司。乙酸（>99%，批号：C0524323）、丙酸（>99%，批号：C10322064）、丁酸（>99%，批号：C10201252）、异丁酸（>99%，批号：C10201253）和腺嘌呤标准品（批号：P03814）购自美国Sigma-Aldrich公司。D-(+)-葡萄糖（批号：S13J11H107301）、没食子酸（批号：Y19M8C36143）和芦丁（批号：Y16M9S61523）购自中国上海源叶生物科技有限公司。L-抗坏血酸（批号：C11491748）购自中国上海麦克林生化科技有限公司。血尿素氮（BUN，批号：C011）和肌酐（批号：C013-2-1）检测试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液（批号：10203）、蛋白酶抑制剂混合物（批号：20215）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白质测定试剂盒和SDS-PAGE上样缓冲液（批号：01411）购自中国北京康为世纪生物科技有限公司。OAT1（批号：GR320240-5）和OCTN2（批号：GR295095-11）的一抗购自英国Abcam公司，ABCG2（批号：42078S）购自美国Cell Signaling Technology公司，URAT1（批号：14937-1-AP）和GLUT9（批号：67530-1-IG）购自美国Proteintech Group公司。山羊抗小鼠IgG HRP（批号：6229）和山羊抗兔IgG HRP（批号：8715）购自美国Signalway Antibody公司。Taq DNA聚合酶试剂盒购自中国北京全式金生物技术有限公司。MiSeq Reagent Kit v3购自美国Illumina公司。Agencourt AMPure XP PCR纯化磁珠购自美国Beckman Coulter公司。其他所有化学品和试剂均为分析纯。对照饲料（AIN93M）和腺嘌呤饲料（AIN93MA，即含有0.2% w/w腺嘌呤的AIN93M）购自中国江苏溧阳舒尔生物技术有限公司，该公司还提供了小鼠饲料中的碳水化合物、蛋白质、脂质和总灰分含量。碳水化合物含量通过分光光度法测定（Van Wychen和Laurens，2020）。样品经10%盐酸完全水解后，用氢氧化钠中和。样品用大孔树脂脱色，最后加入DNS进行显色反应。在520 nm波长下测定吸光度，并以葡萄糖为标准计算碳水化合物含量。总多糖含量采用苯酚-硫酸法测定（Yue等，2015）。将2 g PFC溶于80 mL水中，加入460 mL 95%乙醇（最终乙醇浓度为80%），沉淀12小时，然后在室温下以3500 rpm离心20分钟得到沉淀。粗多糖采用三氯乙酸法去蛋白。然后，将样品溶于蒸馏水并稀释至50 mL。以葡萄糖为多糖测定的参考标准。还原糖采用滴定法（碱性酒石酸铜溶液）测定。蛋白质采用凯氏定氮法测定。脂肪采用Rose-Gottlieb提取法蒸发提取溶剂后称重法测定。灰分按照AOAC方法945.46，在灼烧后通过重量差测定。水分通过在105°C下加热并在干燥器中干燥后，通过重量差计算得出（Rombaut等，2007）。采用高效液相色谱（HPLC）法，以一系列抗坏血酸标准品测定维生素C（Ma等，2020）。总酚和总黄酮采用分光光度法测定，其含量分别以没食子酸当量（GAE）（mg/g）和芦丁当量（mg/g）表示（Xia等，2011b）。PFC的有机酸组成采用Dionex Integration高效离子色谱（HPIC）法（ThermoFisher Scientific，NY，USA）和梯度系统进行分析（补充表1）。雄性SPF级C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，并饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心（许可证号：SYXK，2018-0012）。所有实验程序均遵循《实验动物护理和使用指南》（美国国家卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达）并经过浙江中医药大学动物伦理与福利委员会批准（伦理批准号：20200813-01）。40只小鼠（7周龄，22.0 ± 2.0 g）被随机分配到四组（每组n = 10）：CNR组（饲喂AIN93M饲料并给予生理盐水）、CNR-P组（饲喂AIN93M饲料并给予500 mg/kg PFC）、CKD组（饲喂AIN93MA饲料并给予生理盐水）和CKD-P组（饲喂AIN93MA饲料并给予500 mg/kg PFC）。成人PFC的剂量为2–6 g，按体表面积法计算，对于20 g的小鼠，此剂量相当于5.2–15.6 mg（人剂量×20 g小鼠的转换系数）。因此，本研究中使用的PFC剂量为500 mg/kg。CNR组和CNR-P组的小鼠饲喂AIN93M饲料。通过灌胃给予PFC或生理盐水，持续4周，期间每周称重一次。在研究最后一天，使用代谢笼收集尿液样本。研究结束时，小鼠用硫喷妥钠麻醉后摘眼球取血。血液样本在37°C下孵育1小时，然后以2500 rpm离心15分钟以分离血清。收集肾脏组织、十二指肠、回肠、盲肠和结肠组织及其内容物，并在-80°C下保存以供进一步分析。肾脏组织在室温下用4%多聚甲醛固定24小时，然后包埋在石蜡中。随后将组织切片切成4 μm厚，并用苏木精和伊红（H&E）染色，根据标准方案进行组织病理学检查。根据制造商的说明测定血尿素氮（BUN）和血清肌酐浓度。将十二指肠、回肠、盲肠和结肠的内容物在PBS中均质化，并在4°C下以13,000 rpm离心10分钟以分离上清液。使用Synergy H1多功能微孔板读数器（BioTek，VT，USA）在96孔板中于700 nm波长下，通过紫外分光光度法测定上清液、血清和尿液中的尿酸（UA）浓度（Jiang等，2021；Niu等，2012）。肾脏组织在RIPA裂解缓冲液中均质化，并使用BCA检测试剂盒测定裂解液的蛋白质浓度。蛋白质在金属浴中加热10分钟变性。含有30 μg总蛋白质的样品通过8% SDS-PAGE凝胶分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在含1% Tween-20的Tris缓冲盐水中用5%（w/v）脱脂牛奶孵育1小时（室温），然后加入抗ABCG2、OCTN2、OAT1、URAT1和GLUT9抗体，在4°C下过夜。洗涤后，加入1:10,000或1:5000稀释的山羊抗小鼠/兔IgG，孵育2小时。使用增强型化学发光系统（Monad，上海，中国）扫描膜。十二指肠、回肠、盲肠和结肠组织同样进行均质化，裂解液通过8% SDS-PAGE凝胶分离。总蛋白质电转移到PVDF膜上，与兔抗ABCG2抗体在4°C下过夜孵育。洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗兔IgG，孵育2小时。如上所述扫描膜。取100 mg盲肠和结肠内容物悬浮于1.2 mL PBS中，均质化2分钟，然后以13,000 rpm离心10分钟。取1 mL上清液与2 mL无水乙醇混合，另取1 mL上清液与1 mL正己烷混合，然后加入100 μL H2SO4。将两种混合物分别在室温和60°C水浴中孵育1小时。使用气相色谱仪（Shimadzu，京都，日本）分析内容物。色谱条件为：DB-5色谱柱，火焰离子化检测器，N2载气流速为1 mL/min，分流比30:1，起始温度30°C保持10分钟，然后以15°C/min的速率升至150°C，样品注射器温度200°C，检测器温度220°C，样品量1 μL。使用Taq DNA聚合酶试剂盒，根据制造商的指南扩增盲肠内容物中的基因组DNA。使用NanoDrop 2000（Thermo，Waltham，USA）评估基因组DNA的质量和数量。使用MiSeq Reagent Kit v3扩增每个样本的16S V3–V4区域，并使用Agencourt AMPure XP PCR纯化磁珠进行纯化。扩增引物为5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′（正向）和5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′（反向），并使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，CA，USA）评估产物的质量。使用Miseq平台上的双端测序策略对文库进行测序。为了提高数据的准确性，使用TrimGalore、Mothur和Usearch软件进行质量控制。将相似度≥97%的序列归为同一操作分类单元（OTUs）。使用Mothur软件和RDP数据库（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）鉴定OTUs。使用Mothur和R软件包（http://www.R-project.org）进行群落条形图、Alpha和Beta多样性分析、热图绘制、主成分分析（PCoA）和物种鉴定，并使用Lefse（https://galaxyproject.org）进行线性判别分析效应大小（Lefse）分析。2.10. 统计分析使用SPSS 19.0软件（IBM公司，美国纽约州阿蒙克市）进行双向方差分析。当F比值显著时，采用LSD事后检验进行事后比较。数据以平均值±标准误（SEM）表示，P < 0.05认为具有统计学显著性。3.1. 青梅发酵产物（PFC）和小鼠饲料的营养及化学特性PFC和小鼠饲料的营养成分如表1所示。在制备PFC产品的过程中，经过长达6小时的煮沸，青梅中的大部分抗氧化化合物（如酚类、黄酮类、维生素C等）已分解或破坏。因此，PFC富含多糖（75.30%，w/w）和有机酸（7.14%，w/w）。主要有机酸为柠檬酸（6.28%，w/w）。PFC的水分含量为10.61%（按重量计）。在整个实验期间，所有组的小鼠均表现出正常的行为和活动水平。研究开始时，各组小鼠的体重无显著差异（P > 0.05；表2）。研究结束时，慢性肾病（CKD）组小鼠的体重显著低于对照正常（CNR）组（P < 0.05），但CKD-P组和CKD组小鼠的体重无显著差异。在两个饮食组中，PFC的给药均不影响体重。H&E染色显示，CNR和CNR-P组小鼠的肾脏组织形态正常，而CKD组小鼠表现出多种特征性的组织学改变，包括相邻近曲小管细胞之间的界限不明显、肾小球萎缩和肾小管肿胀。然而，CKD-P组小鼠的上述病变有所改善（图1）。与CNR组相比，CKD组的血尿素氮（BUN）和血清肌酐浓度显著升高，但与CKD组相比，CKD-P组显著降低（图3）。如图2所示，在给予腺嘌呤饮食诱导后，血清尿酸（UA）浓度显著增加，而24小时尿液、十二指肠、回肠、盲肠和结肠内容物中的UA浓度显著降低（P < 0.05），表明CKD小鼠的UA排泄减少。然而，PFC显著降低了CKD小鼠的血清UA浓度（P < 0.05），并显著上调了CKD组十二指肠、回肠和盲肠内容物中的UA浓度（P < 0.05）。![]()
表1 青梅发酵产物（PFC）和小鼠饲料的营养及化学特性（%，w/w）
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表2 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠体重的影响。
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图2. 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠血清（A）、尿液（B）、十二指肠（C）、回肠（D）、盲肠（E）和结肠内容物（F）中尿酸（UA）水平的影响。不同字母表示存在显著差异（P < 0.05）。数据为平均值±标准误（SEM）（n = 9–10）。
3.5. 青梅发酵产物（PFC）对肾脏和肠道中尿酸转运体表达的影响如图4所示，对照正常（CNR）组和对照正常加PFC（CNR-P）组之间尿酸转运体的蛋白表达无差异。然而，与慢性肾病（CKD）组相比，PFC降低了CKD-P组尿酸转运体1（URTA1）和葡萄糖转运体9（GLUT9）的蛋白表达，同时增加了三磷酸腺苷结合盒转运体G2（ABCG2）、有机阳离子转运体2（OCTN2）和有机阴离子转运体1（OAT1）的蛋白表达（P < 0.05），这暗示了尿酸（UA）排泄的促进。腺嘌呤饮食显著降低了小鼠十二指肠、回肠、盲肠和结肠中ABCG2蛋白的表达（图5），但PFC显著改善了回肠、盲肠和结肠中的这种变化，这与尿酸排泄增加相一致。这些发现与肾脏中的情况相似（图5B-D），但PFC对十二指肠中ABCG2蛋白的表达无显著影响（图5A）。![]()
图3. 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病（CKD）小鼠血清肌酐（A）和血尿素氮（BUN）（B）的影响。不同字母表示存在显著差异（P < 0.05）。数据为平均值±标准误（SEM）（n = 9–10）。![]()
图4. 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠肾脏尿酸转运体蛋白表达的影响。不同字母表示存在显著差异（P < 0.05）。数据为平均值±标准误（SEM）（n = 3）。
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图5. 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠肠道转运体ABCG2表达的影响。不同字母表示存在显著差异（P < 0.05）。数据为平均值±标准误（SEM）（n = 3）。
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图6. 青梅发酵产物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠肠道短链脂肪酸（SCFAs）含量的影响。不同字母表示存在显著差异（P < 0.05），大写字母代表盲肠，小写字母代表结肠。数据为平均值±标准误（SEM）（n = 3）。
3.6. 青梅发酵产物（PFC）对盲肠和结肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）浓度的影响短链脂肪酸是肠道中碳水化合物微生物发酵的产物，对肠道健康至关重要。各组小鼠盲肠和结肠内容物中主要短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的浓度如图6所示。慢性肾病（CKD）组小鼠盲肠中乙酸、丙酸、正丁酸和异丁酸（图6A-D）的浓度显著低于对照正常（CNR）组（P < 0.05）。此外，CKD组小鼠结肠中丙酸的浓度也显著低于CNR组（P < 0.05）。然而，PFC显著增加了盲肠和结肠内容物中短链脂肪酸的浓度。特别是，CKD-P组小鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸的浓度显著高于CKD组（P < 0.05）。3.7. 青梅发酵产物对盲肠内容物微生物结构的影响为了探讨盲肠微生物的丰富度和多样性，我们计算了由Chao 1、ACE、Shannon和Simpson指数分析的α多样性。如表3所示，CNR-P组微生物的丰富度（Chao 1和ACE指数）高于CNR组（P < 0.05），同样，CKD-P组也显著高于CKD组（P < 0.05）。此外，PFC给药增加了对照饮食喂养小鼠的多样性水平（Shannon和Simpson指数），但CKD-P组和CKD组之间的多样性没有差异。我们使用主坐标分析（PCoA）来表征各组微生物群落的整体结构。基于PCoA得分图中Bray-Curtis距离的β多样性分析显示，CNR、CNR-P、CKD和CKD-P组的肠道微生物群落高度不同。存在四个聚类，分别对应四个组，但CKD-P组的分布与CNR和CNR-P组更为相似，而与CKD组不同（图7）。在所有组中共发现了326种细菌物种，但CNR-P组和CKD-P组盲肠内容物中的微生物物种数量分别显著高于CNR组和CKD组（图8）。在门水平上，腺嘌呤饮食喂养减少了小鼠体内变形菌门和厚壁菌门的数量，增加了拟杆菌门的丰度（图9A）。CNR-P组中变形菌门的丰度较低，但在CKD-P组中并未降低。此外，与CNR组相比，CKD组中拟杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、副拟杆菌属、另枝菌属和罗姆布茨氏菌属的丰度较高，但PFC给药显著降低了拟杆菌属、假黄色单胞菌属、螺杆菌属、梭菌属IV、乳杆菌属和另枝菌属的丰度，而对副拟杆菌属无影响（图9B）。然而，包含益生菌种约翰逊氏乳杆菌和动物乳杆菌的乳杆菌属在CKD-P组中显著更为丰富（图9C）。图10显示了盲肠微生物属的热图，该图与上述表达数据一致。我们进行了线性判别分析效应大小（LEfSe）来鉴定各组中差异表示的微生物分类群。从内到外，每层节点分别代表门、纲、目、科、属和种，PFC引起的差异如图11所示。在门水平上，CKD-P组小鼠的肠道微生物中拟杆菌门的丰度高于其他组。在纲水平上，PFC降低了ε-变形菌纲的相对丰度，增加了紫单胞菌科的相对丰度。在科水平上，PFC降低了螺杆菌科、梭菌科1、互养菌科、拟杆菌科、理研菌科、瘤胃球菌科和乳杆菌科的丰度，而增加了丹毒丝菌科、普雷沃氏菌科和紫单胞菌科的丰度。综上所述，PFC给药增加了盲肠中微生物的丰富度、多样性和物种数量，从而减轻了腺嘌呤饮食喂养引起的肠道微生物失调。![]()
图7. 益生元纤维复合物（PFC）对腺嘌呤诱导的慢性肾脏病（CKD）小鼠盲肠微生物群结构的主坐标分析（PCoA）评分的影响。红色代表CKD组，紫色代表对照正常饮食组（CNR），蓝色代表对照正常饮食+PFC组（CNR-P），黄色代表CKD+PFC组（CKD-P）。数据为平均值±标准误（n = 9–10）。
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图8. 维恩图展示了不同处理组小鼠盲肠微生物群的OTU（操作分类单元）重叠情况。红色代表对照正常饮食组（CNR），黄色代表对照正常饮食+PFC组（CNR-P），紫色代表慢性肾脏病组（CKD），蓝色代表慢性肾脏病+PFC组（CKD-P）。数据为平均值±标准误（n = 9–10）。
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表3 各组小鼠盲肠微生物群的丰富度和α多样性
讨论慢性肾脏病（CKD）以肾功能的缓慢且进行性下降为特征。尿酸（UA）被认为在CKD的发展中起作用（Su等，2017）。UA在肾脏中经历肾小球滤过、肾小管重吸收、分泌以及分泌后重吸收，这一过程由多种转运蛋白介导（Hosomi等，2012）。URAT1负责将尿酸从肾小管腔重吸收到血液中，以维持血液尿酸稳态（Eraly等，2008）。相反，OAT1介导尿酸从血液分泌到肾小管腔中，并表达在肾近端小管基底侧膜上（Su等，2014；Wang等，2019）。OCTN2表达在肾近端小管中，已知可转运有机阳离子（Ding等，2013）。GLUT9表达在基底侧膜上，也能够将UA从肾小管转运到循环中（Cui等，2020）。最后，ABCG2是一种高容量尿酸排出转运体，在肾脏和肾外UA排泄中均发挥重要作用（Wang等，2019）。先前的研究表明，ABCG2在肠上皮细胞顶端膜上丰富表达，将UA从循环转运到肠腔内（Chen等，2018）。一些天然活性化合物已被证实对CKD具有保护作用，如泽泻（Dou等，2018）。近年来，研究表明天然活性多糖是治疗腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭的一种有前景的候选药物，可开发为降UA药物用于治疗CKD，如大豆可溶性多糖（Hou等，2020）、金银花多糖、蛹虫草多糖（Ma等，2014）和杏鲍菇多糖（Niu等，2012）。PFC是一种在日本和中国销售的商业产品，富含多糖（75.30%，w/w）。在本研究中，腺嘌呤饮食喂养的小鼠血清肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）和UA浓度显著增加（图2、3），而肠道和尿液中UA的排泄减少（图2）。高血清UA浓度被认为是CKD进展的重要促进因素（Shchelochkov等，2019）。本研究表明，PFC显著改变了血清和尿液中的UA浓度。此外，我们还发现腺嘌呤饮食喂养降低了肾脏中ABCG2、OCTN2和OAT1的表达，并增加了URAT1和GLUT9的表达，这与先前研究的结果一致（Liu等，2018）。PFC对上述尿酸转运体的表达具有明显的调节作用（图4）。因此，PFC的降UA作用可能是通过对尿酸转运体表达的影响来实现的。此外，腺嘌呤饮食喂养降低了肠内容物中的UA浓度和肠道中ABCG2的表达（图2、5）。最近，其他研究表明，几种尿毒症毒素（如吲哚硫酸盐、对甲酚硫酸盐和马尿酸）是由腺嘌呤饮食诱导的CKD小鼠肠道微生物群产生的，可以抑制ABCG2介导的底物特异性转运（Lowenstein和Nigam，2021）。肠道微生物群产生的丁酸是结肠中ABCG2的底物，随着丁酸浓度的增加，ABCG2的表达也会增加（Gill和Dudeja，2011）。为了在本研究结果的基础上进一步深入，有必要对微生物组成变化对肠道UA排泄的影响进行进一步分析，并确定涉及的微生物种类。此外，研究表明，膳食多糖可以在某些异常条件下调节肠道微生物群（Ding等，2019；Wang等，2020）。因此，多糖降低UA和治疗CKD的能力可能与肠道微生物群有关。
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图9. 不同处理组小鼠盲肠微生物在门（A）、属（B）和种（C）水平上的相对丰度。数据为平均值±标准误（n=9-10）。
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图10. 不同处理组小鼠盲肠微生物在属水平上的热图分析。1代表CNR组，2代表CNR-P组，3代表CKD组，4代表CKD-P组。数据为平均值±标准误（n=9-10）。
晚期肾损伤患者的肠道微生物群组成与健康人显著不同（Li等，2019；Ng等，2005）。因此，本研究对各组小鼠的盲肠内容物进行了16S rDNA测序。结果表明，慢性肾脏病（CKD）小鼠的肠道微生物组成与对照组小鼠存在显著差异（图9）。先前的一项研究发现，CKD患者体内乳杆菌属的丰度较低，而改善肠道环境可以减缓肾病的进展（Yoshifuji等，2016）。然而，我们发现乳杆菌属在CKD组中的丰度更高。由于茯苓皮多糖（PFC）可能对尿酸（UA）的排泄有积极作用，因此鼓励进一步研究这是否与肠道中乳杆菌丰度的变化有关。已知乳酸杆菌约翰逊氏FI9785（Lactobacillus_johnsonii_FI9785）和乳酸杆菌动物氏（Lactobacillus_animalis）对动物具有益生菌作用（Karunasena等，2013；Mayer等，2020），我们发现这些特定物种在CKD-P组中的丰度显著更高，这暗示PFC可能促进益生菌乳酸杆菌物种的繁殖。在CKD患者中，小肠对蛋白质的吸收受损，这可能导致蛋白质营养不良，这是CKD患者中一个众所周知的问题。当小肠对蛋白质的吸收受损且碳水化合物可用性降低时，如拟杆菌等的蛋白水解细菌会越来越多地发酵蛋白质以产生能量，这也会产生潜在的有毒代谢产物，如酚类和吲哚（Bammens等，2003；Gryp等，2017）。酚类物质已被证明可以抑制人体尿酸转运蛋白（如ABCG2）的活性（Evenepoel等，2009）。Li等研究表明，拟杆菌属在CKD患者的结肠中富集（Eraly等，2008），我们的结果与这一发现一致（图9）。1986年的研究显示，粪便中的主要蛋白水解细菌属是拟杆菌属，但罗姆布茨氏菌（Romboutsia）、副拟杆菌（Parabacteroides）和梭菌（Clostridium）也能产生有毒代谢产物（Evenepoel等，2009）。然而，在本研究中，PFC给药后，拟杆菌属和梭菌IV（Clostridium_IV）的丰度降低，而罗姆布茨氏菌和副拟杆菌的丰度未受影响。由此导致的潜在毒素产生减少可能解释了观察到的ABCG2表达增加，以及PFC诱导的肠道UA排泄增加。此外，PFC还显著降低了腺嘌呤饮食诱导的CKD小鼠中幽门螺杆菌（Helicobacter）的丰度，这与先前的一项研究结果一致，该研究表明梅汁可以减少幽门螺杆菌的数量（Nakajima等，2006）。短链脂肪酸（SCFAs）是结肠中的主要能量来源，由小肠中未吸收的碳水化合物代谢产生。SCFAs在大肠中通过碳水化合物发酵产生（Furuse等，2014）。它们包括乙酸、丙酸和丁酸，通常以约60:25:15的比例产生，在结肠和盲肠中发挥重要作用（Gill和Dudeja，2011）。先前的研究表明，丁酸和丙酸可以在肾脏中发挥抗炎和保护作用。此外，肠道微生物产生的丁酸是结肠中ABCG2的底物，随着丁酸浓度的增加，ABCG2的表达也会增加。因此，我们在本研究中测量了小鼠盲肠和结肠内容物中的SCFAs浓度，并发现PFC增加了这些浓度。这暗示PFC被肠道微生物代谢以产生SCFAs，这可能会增加ABCG2的表达和UA的排泄。盲肠中的SCFAs浓度高于结肠中的浓度，这可能是因为它们主要在结肠中被吸收。此外，CKD组肠道内容物中的SCFAs浓度显著低于对照组（CNR组）（图6），这与先前的研究结果一致（Castillo-Rodriguez等，2018）。当然，PFC来源的SCFAs对肠道微生物群的准确影响以及PFC在UA排泄和肠道微生物群中的更详细机制尚不清楚。尽管有一些累积研究表明CKD与肠道微生物群组成的紊乱密切相关，但肠道微生物群在CKD的发生和发展中的重要性仍不清楚。未来，我们计划研究PFC诱导的肠道微生物代谢物的变化，并进一步探讨肠道微生物群与UA排泄之间的关系。综上所述，PFC的摄入可以改善CKD引起的肾脏损伤，并通过逆转肾脏和肠道尿酸转运蛋白的异常表达来促进UA的排泄。它还增加了大肠中SCFAs的浓度，并降低了拟杆菌属、假黄酮菌属（Pseudoflavonifractor）、幽门螺杆菌属、梭菌IV属和Allobaculum属的丰度。这些发现可能有助于指导含有PFC的功能性食品的开发和使用。
