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方法：建立了H9C2细胞氧化应激损伤模型和急性心力衰竭小鼠模型，以评估附子碱和甘草次酸（GA）的最佳协同保护浓度。随后合成了一种GA探针，并采用化学和生物学方法进行靶标钓取。最后，通过荧光共定位、蛋白质印迹、蛋白质相互作用分析、分子对接和钙离子成像等方法验证了靶标及其功能。
结果：当附子碱和甘草次酸的浓度比为1:1或2:1时，达到了最佳的药效潜力。在这些比例下，它们通过MDH2和CALR调节了钙信号通路下游蛋白的水平，从而平衡了心肌组织中的钙离子稳态，并减轻了心力衰竭的影响。
结论：本研究旨在探讨传统中药（TCM）对药附子碱和甘草次酸（两者均为活性代谢产物）在发挥心脏作用时的配伍相容性，鉴定其直接生物靶点，并验证其配伍机制。
1 引言
心力衰竭（HF）是指心脏无法向周围组织供应血液和氧气，从而无法满足其代谢需求的状态。在现代社会，由慢性全身性低灌注引起的突发性心脏死亡或多器官衰竭是心力衰竭患者的主要死因（Lane等，2005）。尽管治疗策略发展迅速，但心力衰竭的预后仍然不佳。患者的高死亡率、发病率和住院需求持续给临床和公共卫生系统带来压力。炎症细胞因子系统的激活、氧化应激和钙离子（Ca2+）稳态失衡会促进心力衰竭的发展，这是心血管疾病的终末阶段（Rogers和Bush，2015）。在病理状态下，心肌细胞中活性氧物种（ROS）水平的激增超过了抗氧化系统的缓冲能力。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CAMKII）的激活还会导致肌浆网中Ca2+的泄漏，从而导致心肌损伤（Reyes Gaido等，2023）。
附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata，即乌头属植物Aconitum carmichaelii Debeaux的侧根）是一种广泛用于治疗心血管疾病的传统中药（TCM）。它对心力衰竭、低血压、冠心病和心肌梗死引起的休克等状况有效（Xing等，2022）。然而，附子具有高度毒性，在《神农本草经》中被列为下品，即“非急症不用”，从而限制了其临床适用性。附子碱是附子被血液吸收的主要代谢产物，具有强心、抗心肌缺血、抗休克和抗心律失常的特性。附子碱可以抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡，提高心肌细胞的活力，调节PERK/EIF2-α/ATF4/Chop通路，抑制ROS诱导的内质网应激，维持线粒体膜电位的稳定性，并抑制细胞色素C向细胞质的释放（Fan等，2020）。
甘草（Glycyrrhizae radix et rhizoma，即甘草属植物Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根）是附子的经典配伍药材，不仅能保留附子的原有强心和镇痛活性，还能减轻附子引起的心肌损伤，并影响有毒代谢产物的代谢以实现解毒（Ke等，2015）。甘草次酸（GA）可以恢复附子引起的心肌Na+-K+-ATP酶活性下降，促进Na+-K+交换，抑制Na+-Ca2+交换，减轻Ca2+超载，降低钙调蛋白/CAMKII的活性，并拮抗乌头碱诱导的大鼠心律失常（Zhang等，2017）。先前的研究表明，附子碱作为一种Ca2+和β2-肾上腺素受体（β2-AR）激动剂，具有显著的强心和抗心肌缺血作用，但也可能导致心律失常。甘草次酸可以抑制附子碱引起的Ca2+水平升高，同时保留β2-AR的激活，从而消除甘草次酸的副作用而不影响其强心作用（Chang等，2020）。然而，附子与甘草次酸组合协同降低毒性并增加/保持其有益作用的具体机制尚不清楚，其临床适用性也尚未确定。
因此，本研究旨在鉴定附子碱和甘草次酸的直接生物靶点，并阐明其作用机制。为此，我们首先分析了附子碱和甘草次酸对氧化损伤心肌细胞的协同保护作用的最佳比例，并评估了其在心力衰竭小鼠中的缓解作用。随后，使用小分子探针鉴定靶蛋白，并通过各种生化实验评估潜在靶点的影响以及附子碱和甘草次酸的作用。
2 材料与方法
2.1 试剂与材料
附子碱（CAT #A0793，纯度≥98%）和甘草次酸（CAT #A0038，纯度≥98%）购自成都慕斯特生物技术有限公司。甘草次酸探针由无锡药明康德有限公司提供。
2.2 实验动物
所有实验方案均按照《实验动物护理和使用指南》执行，并经天津中医药大学动物伦理审查委员会批准（TCM-LAEC2021136）。C57BL/6JNifdc小鼠（雄性，20–25 g）购自北京维通利华动物实验中心（SCXK2018-0004，北京）。小鼠在20–25°C的标准动物房中，保持12小时自动光照/黑暗周期饲养，可自由获取水和食物。
2.3 小鼠急性心力衰竭（AHF）的检测
将雄性小鼠随机分为11组（每组n=6）。除对照组外，其他组在建立阿霉素（Dox）诱导的AHF模型后24小时接受以下治疗：（1）对照组（Con，腹腔注射（i.p.）生理盐水），（2）模型组（M，i.p.生理盐水），（3–6）附子碱组（F，i.p. 0.08、0.16、0.32和0.64 mg/kg），（7–10）组合组（附子碱与甘草次酸（FG），i.p.浓度1:1），以及（11）阳性组（右雷佐生，DEX，i.p. 150 mg/kg）。给药7天后，使用小动物实时超声成像系统（Vevo 2100，Visual Sonics，加拿大）检查小鼠，并确定心功能指标，如左室射血分数、左室缩短分数和心输出量。随后收集血清样本，并使用乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白（CTnT）、肌酸激酶（CK）和钙神经素（CAN）酶联免疫吸附测定试剂盒评估心力衰竭的程度。收集心脏组织进行免疫荧光分析和使用苏木精和伊红（H&E）染色的形态学观察。
2.4 细胞培养
H9C2大鼠心肌细胞系（H9C2）购自美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA，USA）。H9C2细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。
2.5 配伍浓度分析
用200 μM H2O2刺激H9C2细胞，并在96孔板中培养2小时。根据棋盘法规则，向每个孔中加入附子碱和甘草次酸，使最终浓度达到0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0 μM。孵育10小时后，进行3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和LDH测定，以确定不同浓度的附子碱和甘草次酸对H9C2细胞的影响。
2.6 靶点捕获
将小鼠分为四组，包括对照组、甘草次酸刺激组、附子碱与甘草次酸探针（1:1）组和甘草次酸探针i.p.组，连续给药3天。在最后一次给药后1小时，从心脏组织中提取蛋白质裂解物用于靶点捕获。
将细胞分为四组。在饥饿8–10小时后，向对照组加入新鲜培养基，向其他组加入药物。孵育10小时后提取细胞蛋白质。
如图3A所示制备叠氮修饰的磁性微球（MMs）。将MMs与CuSO4（1 mM）和Tris（2-羧乙基）磷化氢盐酸盐（TCEP）（1 mM）一起加入到蛋白质裂解物中，并在4°C下孵育12小时。通过磁分离收集MMs，并用预冷的磷酸盐缓冲盐水冲洗。使用300 μL二硫苏糖醇（100 mM）在4°C下还原结合的蛋白质30分钟，然后收集上清液进行15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。最后，使用胰蛋白酶消化蛋白质条带，并使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析甘草次酸、甘草次酸探针以及附子碱与甘草次酸探针捕获的蛋白质。LC-MS/MS分析由北京蛋白质创新有限公司（北京）完成。
2.7 共定位分析
用甘草次酸探针和附子碱与甘草次酸探针处理H9C2细胞6小时，然后用4%多聚甲醛固定。将固定的细胞在点击缓冲液（含1 mM CuSO4、1 mM TCEP和0.1 mM TBTA的10%二甲基亚砜）中与叠氮香豆素示踪剂孵育2小时，温度为37°C。然后，在4°C下用苹果酸脱氢酶2（MDH2）抗体（1:500）孵育细胞12小时，再在37°C下用Alexa Fluor 594偶联的山羊抗小鼠抗体（1:1000）孵育30分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica SP8，Carl Zeiss，Oberkochen，德国）进行荧光成像。甘草次酸探针的检测波长为488/516 nm（Ex/Em），MDH2的检测波长为594/617 nm（Ex/Em）。
2.8 靶蛋白预测
使用Molecular Operating Environment软件包（Chemical Computing Group, Inc.）构建并最小化了附子灵及其潜在靶点的结构。采用Auto Dock 4.2版（Olson Laboratory, La Jolla, CA）和混合拉马克遗传算法模拟配体-受体结合。四元数和扭转的步长参数均设置为30。对每种代谢产物进行了30次独立实验。其他所有参数均使用默认值。结合自由能是根据疏水键、离子键、氢键以及蛋白质和配体之间的范德华相互作用的贡献计算得出的。
2.9 H9C2细胞损伤检测
使用多柔比星（Dox）建立H9C2细胞损伤模型。实验细胞分为以下10组：（1）对照组（Con），（2）模型组（M，Dox），（3-6）附子灵组（0.01、0.1、1和10 μM），以及（7-10）联合组（附子灵与甘草酸（GA），浓度1:1）。细胞经4 μM多柔比星刺激2小时后，除对照组外，所有组均给予附子灵或甘草酸并孵育22小时。检测H9C2细胞中的钙荧光强度、F-肌动蛋白染色和免疫荧光。收集细胞上清液以测量兰尼碱受体2（RyR2）的表达。
2.10 蛋白质热偏移和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）分析
为了在心脏组织样本中进行热偏移分析，将蛋白质暴露于10^-5 mol/L的代谢产物中，并在4°C下孵育过夜。随后，在4°C下以12,000 rpm离心蛋白质10分钟，并将上清液转移至1.5 mL微量离心管中。制备好裂解液后，将上清液等分，分别在Thermomixer Compact上于不同温度下加热5分钟，然后冷却至24°C。在4°C下以12,000 rpm离心10分钟后，收集上清液进行Western blotting分析。
对于DARTS分析，使用TNC缓冲液中的不同浓度链霉素稀释蛋白质，以实现酶与蛋白质浓度比为1:200、1:400、1:600、1:800和1:1000。在室温下进行3分钟酶解后，将蛋白质在金属浴中加热以进行Western blotting分析。
2.11 Western blot分析
使用SDS-PAGE分离蛋白质，并将其转移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂干奶粉在24°C-26°C下封闭膜1小时，然后在4°C下与针对钙网蛋白（CALR）、天冬氨酸β-羟化酶（ASPH）、MDH2、心肌细胞增强因子2C（MEF2C）、钙结合蛋白2（CASQ2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（CST, MA, USA）的一抗孵育过夜。使用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水洗涤膜30分钟，然后在24°C-26°C下与二抗（CST, MA, USA）孵育3小时，并再次洗涤。将膜与化学发光辣根过氧化物酶底物孵育，并暴露于增强化学发光和Western blot检测试剂（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）中。
2.12 蛋白质-蛋白质相互作用分析
将纯化的MDH2（20 mg/mL）固定在SMAP芯片上，并使用附子灵作为流动相与蛋白质竞争结合和解离。流速设置为30 mL/min，并连续监测700秒。收集数据以计算解离常数。
2.13 统计分析
所有数据均表示为均值±标准差，使用Graph Pad Prism 7.0软件分别通过学生t检验和方差分析对两组和多组之间的显著差异进行分析。统计学显著性设定为p < 0.05。
3 结果
3.1 附子灵与甘草酸对H9C2细胞的不同浓度比影响
为了确定附子灵（Fuziline）与甘草酸（GA）的最佳配伍比例，本研究使用H2O2建立了H9C2细胞的氧化应激损伤模型。直方图和可视化图表（图1A、C）显示，当附子灵与甘草酸的比例为2:1时，细胞存活率最高。乳酸脱氢酶（LDH）泄漏率分析（图1B、D）表明，当附子灵与甘草酸的比例为1:1时，细胞上清液中的LDH泄漏率最低。
为了进一步确定最佳比例，我们使用CalcuSyn软件计算了不同比例的协同指数（CI）值，并根据Chou-Talalay中效原理评估了附子灵与甘草酸的联合作用。观察发现，当附子灵浓度在0.1 μM至0.8 μM范围内，且附子灵与甘草酸以1:1或2:1的比例应用时，MTT和LDH的CI值均小于1，表明在此浓度比例下附子灵与甘草酸具有协同作用（图1E）。
3.2 附子灵与甘草酸配伍对急性心力衰竭（AHF）小鼠的药效评价
我们确定了附子灵与甘草酸1:1的配伍为最佳比例，并验证了其对AHF小鼠的效果。如图2A所示，与对照组相比，模型组小鼠表现出心室壁明显变薄、心室扩大、室壁运动减慢和收缩力下降。与模型组相比，给药组小鼠的上述状况有所改善。连续给药7天后，使用M型超声心动图检测长轴切面，并评估心功能指标（图2B）。模型组的心输出量（CO）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）和室间隔厚度（IVS）均显著低于对照组（p < 0.05），而左室收缩期内径（LVID; s）和左室收缩期容积（LV VOL; s）则显著高于对照组（p < 0.05）。与模型组相比，FG 0.64 mg/kg组CO显著降低（p < 0.05），F 0.08 mg/kg、FG 0.08 mg/kg、F 0.16 mg/kg和FG 0.64 mg/kg组EF和短轴缩短率显著降低（p < 0.05）。F 0.08 mg/kg、FG 0.08 mg/kg、F 0.32 mg/kg和FG 0.64 mg/kg组收缩期末左室后壁厚度显著降低（p < 0.05）。F 0.08 mg/kg和FG 0.08 mg/kg组左室收缩期内径有减小趋势（p < 0.05），而F 0.08 mg/kg和FG 0.08 mg/kg组左室收缩期容积显著降低（p < 0.05）。
对照组小鼠的心脏H&E染色切片显示心肌层无明显变化（图2C）。心肌细胞排列有序，心肌间隙正常。模型组分析显示心肌细胞胞质淡染，细胞形态疏松，心肌水肿，并有炎性细胞浸润。给药组小鼠的心肌细胞水肿和炎性细胞浸润程度有不同程度的改善，表现出一定的心肌保护作用。
基于生物标志物肌酸激酶同工酶（CAN）、LDH、肌酸激酶（CK）和心肌肌钙蛋白T（CTnT）血清水平的变化，评估了附子灵与甘草酸配伍组对HF小鼠的缓解作用（图2D）。结果表明，FG 0.08、F 0.16、FG 0.16和F 0.32 mg/kg组的CAN水平显著低于模型组（p < 0.05）。FG 0.16、F 0.32、FG 0.32、F 0.64、FG 0.64 mg/kg和地塞米松（DEX）组的CTnT水平显著降低（p < 0.05），FG 0.32 mg/kg、FG 0.64 mg/kg和DEX组的LDH水平显著降低（p < 0.05），模型组CK水平呈上升趋势，而F 0.16、FG 0.16、F 0.32和FG 0.32 mg/kg组的血清CK水平显著降低（p < 0.05），但F 0.64 mg/kg、FG 0.64 mg/kg和DEX组的CK水平显著升高（p < 0.05）。这些观察结果表明，附子灵与甘草酸配伍组在一定程度上改善了小鼠的AHF状况。
图1 附子理中与甘草不同比例配伍对细胞的影响。（A）H9C2细胞存活率。（B）H9C2细胞乳酸脱氢酶（LDH）泄漏率。（C）棋盘式配伍下H9C2细胞存活率的可视化图。（D）棋盘式配伍下H9C2细胞LDH泄漏率的可视化图。（E）附子理中与甘草不同比例配伍的协同指数图。
3.3 甘草与附子理中配伍的直接靶点钓取与验证
为鉴定两种代谢产物配伍前后生物靶标蛋白的变化，我们合成了一种甘草探针用于点击化学反应（图3A）。在配伍组的细胞和心脏组织中，有效捕获了多种蛋白质。在不同深度下观察到30至50千道尔顿（kDa）之间的蛋白条带。这可能是由于附子理中与甘草探针发生竞争性结合所致（图3B）。
我们使用Q Exactive LC-MS/MS进行蛋白质鉴定。LC-MS谱图分析显示，细胞中有50种蛋白质，心脏组织中有240种蛋白质（图3C），其中16种蛋白质与GeneCard数据库中的心脏病相关靶点有关。进一步分析确定了以下四种与Ca2+调节密切相关的蛋白质：苹果酸脱氢酶2（MDH2）、钙网蛋白（CALR）、活化C激酶1受体（RACK1）和CRK原癌基因接头蛋白（CRK）。其中，MDH2和CALR在细胞和心脏组织中的综合得分最高；因此，我们对MDH2和CALR进行了后续实验验证。Western blot结果显示，附子理中能够竞争性结合MDH2，从而减少甘草探针捕获的蛋白量，然而，加入附子理中后，CALR的浓度并未显著降低（图3D）。因此，MDH2被认为是附子理中的潜在靶点。
此外，我们使用AutoDockTools 1.5.6软件验证了MDH2、CALR与附子理中之间的分子对接（图3E）。附子理中可通过氢键与MDH2的Ser869、Tyr438和Lys380位点结合，结合能为-7.22千卡/摩尔（kcal/mol）。附子理中还可通过氢键与CALR的His68、Tyr82、Arg138和Thr36位点结合，结合能为-8.01 kcal/mol。
为验证甘草和附子理中在H9C2细胞中对MDH2的结合情况，我们进行了荧光共定位实验。与对照组相比，甘草探针组显示出强烈的红色荧光（图3F），加入附子理中后，荧光强度减弱。这表明附子理中和甘草探针结合于同一靶点，且由于附子理中与MDH2的竞争性结合，甘草探针的结合量和荧光强度均降低。
本研究中，附子理中通过靶向MDH2发挥其毒性作用。因此，我们使用心脏组织的蛋白裂解液进行了蛋白质结合实验。与对照组相比，在75°C下用附子理中处理后，MDH2的热稳定性增加，附子理中保护了MDH2免受水解（图3G，H）。使用Gator软件测定，附子理中与纯化MDH2的结合常数为17.08微摩（μM）（图3I），这进一步证实了附子理中与MDH2之间的相互作用。
图2 附子理中和甘草对急性心力衰竭（AHF）小鼠的影响。（A）超声M型长轴切面图。（B）不同给药组对急性心力衰竭小鼠心功能的影响。（C）不同给药组小鼠心脏的形态学变化。（D）不同给药组中肌酸激酶同工酶（CAN）、心肌肌钙蛋白T（CTnT）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）的含量变化（n = 6）。
图3 直接靶点钓取与验证。（A）甘草（GA）功能化磁性微球的制备。（B）通过SDS-PAGE评估甘草探针的蛋白捕获能力。（C）甘草探针与附子理中重叠靶点的示意图。（D）甘草探针捕获靶点的Western blot验证分析。（E）附子理中与苹果酸脱氢酶2（MDH2）和钙网蛋白（CALR）的分子对接验证。（F）甘草探针（红色）与MDH2蛋白（绿色）的荧光共定位分析。（G）附子理中对MDH2的热稳定作用。（H）附子理中对MDH2的药物亲和反应靶稳定性（DARTS）分析。（I）生物层干涉分析。
图4 附子理中和甘草对多柔比星（Dox）引起的细胞损伤的影响。（A）不同给药浓度下22小时后钙离子荧光强度的变化。（B）细胞内钙离子浓度变化的定量图。（C）不同给药浓度下22小时后兰尼碱受体表达的变化。
3.4 附子理中与甘草配伍对多柔比星诱导损伤调节作用的研究
为探究附子理中和甘草在体外的作用效果，我们建立了多柔比星损伤模型。附子理中通过增加Ca2+含量来减轻心律失常甚至心力衰竭（HF），而甘草则可缓解这一作用。因此，我们研究了附子理中与甘草配伍对受损H9C2细胞中Ca2+水平的调节作用。Ca2+成像结果显示，当附子理中浓度为0.01、0.1和1 μM时，与模型组相比，附子理中组和配伍组的荧光强度显著降低（p < 0.05）。然而，在10 μM附子理中存在下，治疗组的Ca2+荧光强度与模型组无显著差异（图4A、B），表明此浓度的附子理中无法抑制H9C2细胞中的Ca2+过载。我们发现，多柔比星诱导的RyR2表达增加在附子理中（1 μM和10 μM）和配伍组（0.1、1和10 μM）中均得到显著缓解（p < 0.05）（图4C）。
3.5 附子理中与甘草通过调节钙信号通路减轻心力衰竭
为了确定附子理中与甘草配伍调节Ca2+水平的机制，我们使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）对Ca2+相关蛋白进行分析和整合。图5A显示，MDH2与CALR相互作用并共同调节钙信号通路中的下游蛋白，即MEF2C、RyR2、CASQ2、三联体（TRDN）和ASPH。当CALR上调时，MEF2C蛋白水平增加，而CASQ2和ASPH的蛋白水平则降低。接下来，我们对心力衰竭（AHF）小鼠进行了Western blot实验。模型组中CALR和MDH2的表达显著增加（p < 0.05），而ASPH的表达则显著降低（p < 0.05）（图5B）。与模型组相比，F 0.08 mg/kg和F 0.16 mg/kg组CALR的表达显著降低（p < 0.05）；F 0.16 mg/kg、FG 0.16 mg/kg、F 0.32 mg/kg和FG 0.32 mg/kg组MEF2C蛋白表达显著降低（p < 0.05）；F 0.08、FG 0.16、F 0.32和FG 0.32 mg/kg组MDH2蛋白表达显著降低（p < 0.05），且FG 0.16 mg/kg组ASPH蛋白表达显著增加（p < 0.05）。附子理中与甘草通过调节MDH2和CALR的表达，进一步调节钙信号通路中CASQ2、MEF2C和ASPH的表达，从而实现协同保护作用。
图5 附子与甘草对钙信号通路的调节作用。（A）钙相关蛋白之间的相互作用网络图。（B）心肌组织中CALR、ASPH、MDH2、MEF2C和CASQ2蛋白的表达情况。（C）给药组（n = 6）心脏中MDH2表达的免疫荧光图像。
4 讨论
MDH2是一种存在于线粒体中的氧化还原酶，参与了许多生理活动，如线粒体能量代谢和活性氧代谢（He等，2022）。MDH2的沉默会降低细胞内ATP水平，并增加ADP/ATP、NAD+/NADH和ROS的水平，这些与Ca2+代谢密切相关（Ruiz等，2008；Xu等，2016）。线粒体中的Ca2+摄取对于ATP的供需平衡和能量代谢是必要的。在心肌细胞耦联过程中，Ca2+通过L型Ca2+通道流入肌浆网（SR），触发SR中Ca2+的释放，与肌钙蛋白C结合，诱导心肌细胞收缩。在舒张期，Ca2+通过SR的Ca2+-ATP酶（SERCA）流入SR，或通过Na+/Ca2+交换体被运输到膜外。β2-AR的激活可以提高胞质中Ca2+瞬变的速率和幅度，从而增加对肌原纤维的力（Hool等，2005）。随着这一功能的增强，由ATP水解产生的ADP通过腺苷酸转运体进入线粒体，F1Fo ATP酶被激活以再生ATP。这加速了电子传递链（ETC.）上的电子流，并促进NADH氧化为NAD+。同时，Ca2+通过线粒体钙单向转运体进入线粒体，并激活三羧酸循环中的脱氢酶，使NADH再生和ETC诱导的氧化达到平衡状态。在收缩性心力衰竭（HF）中，收缩期Ca2+水平的一过性下降会导致功能障碍，这主要是由于SERCA活性降低和RyR2受体泄漏导致SR中Ca2+负荷减少所致。在受损的心肌细胞中，NADH和NADPH被氧化，这减少了由ETC产生的ATP还原当量，并触发ROS释放（Kohlhaas等，2017；Kohlhaas和Maack，2010）。
作为内质网中的主要钙结合分子蛋白，CALR参与调节钙稳态、凋亡、心血管炎症等生理和病理功能。在静息状态下，CALR的C端结构域与Ca2+结合，促进Ca2+在内质网腔中的储存。当CALR发生糖基化时，它可以与SERCA2b的C端结合。当内质网中的Ca2+浓度降低时，两者解离，SERCA被激活，促进Ca2+从细胞质运输到内质网。当内质网中的Ca2+浓度达到一定水平时，两者结合抑制SERCA的活性，从而减少Ca2+从细胞质到内质网的运输，这表明CALR是内质网中SERCA2b的Ca2+受体（John等，1998）。缺血再灌注导致CALR过表达，引起严重的内质网应激和Ca2+稳态紊乱，从而激活内质网的凋亡信号通路，诱导心肌细胞损伤（Lynch等，2006；Venkatesan等，2021）。我们使用生化技术验证了这两种靶蛋白，并发现附子理中和甘草在同一浓度下与MDH2具有强竞争性结合关系，表明MDH2可能是附子理中的直接靶标，而CALR可能是甘草在调节Ca2+稳态中的特异性靶标。
根据IPA的结果，MDH2与CALR相互作用，调节Ca2+通道中的蛋白，如CASQ2、JCN和MEF2C。CASQ2是心脏中的主要Ca2+储存蛋白。作为SR中的Ca2+缓冲剂，它不仅决定了SR的Ca2+储存能力，还参与了兴奋-收缩耦联过程中SR中Ca2+的释放（Knollmann等，2006）。在Ca2+存在下，CASQ2与SR跨膜蛋白TRDN和JCN结合，形成RyR2通道调节复合物。在心脏兴奋-收缩耦联伴随Ca2+释放过程中，SR中的Ca2+水平降低，CASQ2-T-J复合物抑制RyR2通道的活性（Terentyev等，2008）。如果CASQ2表达受到抑制，会促进CALR表达和RyR2磷酸化，从而降低SR中的Ca2+含量并延迟Ca2+再摄取（Song等，2007）。JCN作为CASQ2和RyR2之间的连接体（Li等，2015）。从RyR2中去除JCN或CASQ2会增加RyR2对腔内Ca2+变化的敏感性，导致延迟去极化诱发的心律失常（Lynch等，2005）。MEF2C是心脏发育和重构过程中至关重要的核心转录因子（Yuan等，2018）。CALR是心肌发育过程中MEF2C转录激活的靶标，在MEF2C的核转位中发挥关键作用。随着细胞内Ca2+浓度的增加，MEF2C去磷酸化并从细胞质转移到细胞核中，促进CALR的表达（Yuan等，2018）。Western blot分析显示，附子理中抑制了HF小鼠中MDH2和CALR的表达，并调节了Ca2+通道中MEF2C、JCN和CASQ2的表达。
在本研究中，我们确定了附子和甘草的最佳配比，这强调了传统中药（TCM）在治疗心肌病方面的疗效和协同作用。此外，我们还确定了附子-甘草组合在治疗心肌病中的靶标，并进一步阐明了其治疗机制。基于本研究，我们可以进一步探究药物对中的更多组分，并为新药开发提供参考。
然而，这些药物的作用通常是系统性的。附子的毒性会影响神经、消化和生殖系统（He等，2023）。未来，我们将研究甘草与附子联合是否可用于治疗新疾病，以及是否能减少附子对其他器官的毒性作用，为药物的安全临床使用提供指导。
5 结论
在本研究中，观察到附子理中和甘草在1:1或2:1的配伍比例下具有最佳药效作用。MDH2通过CALR调节Ca2+信号通路下游蛋白的水平，以平衡心肌组织中的Ca2+稳态并减轻心力衰竭（HF），是附子理中和甘草的直接靶标。
