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摘要
饮食中火麻仁摄入量对心脏缺血-再灌注损伤的影响。《美国生理学杂志：调节、整合与比较生理学》292: R1198 –R1203, 2007。首次发表于2006年11月22日；doi:10.1152/ajpregu.00661.2006。—多不饱和脂肪酸（PUFAs）对缺血具有显著的心脏保护作用。火麻仁含有高比例的多不饱和脂肪酸，即亚油酸（LA）和α-亚麻酸（ALA），它们可能对缺血后的心脏功能产生相反的影响。目前尚无关于饮食中火麻仁摄入量对心血管系统影响的报道。本研究将40只雄性Sprague-Dawley大鼠平均分为四组，分别喂食12周的正常大鼠饲料，并补充火麻仁（5%和10%）、棕榈油（1%）或作为对照的10%部分脱脂火麻仁。喂食5%或10%火麻仁补充饲料的大鼠血浆中ALA和γ-亚麻酸水平显著升高，但在心脏组织中，仅喂食这些饲料的大鼠ALA水平显著升高，与对照组相比有显著差异。饮食干预完成后，通过测量发展张力、静息张力、张力发展和松弛速率以及期外收缩次数来评估缺血后心脏功能。喂食火麻仁补充饲料的大鼠心脏在再灌注期间表现出显著更好的最大收缩功能恢复，以及更高的张力发展和松弛速率，优于其他组的大鼠心脏。然而，这些心脏并未受到保护而免于出现期外收缩，也未因任何饮食干预而改变缺血或再灌注期间的静息张力增加。我们的数据表明，饮食中的火麻仁可以在缺血后再灌注期间提供显著的心脏保护作用。这似乎归因于其高度富集的多不饱和脂肪酸含量。
正文
不同类型的脂肪对心血管系统有不同的影响。例如，饱和脂肪和反式脂肪酸被认为会增加冠心病的风险（13, 16, 17），而单不饱和脂肪和多不饱和脂肪则与风险降低相关（13, 16）。多不饱和脂肪酸（PUFAs）因其对经受缺血-再灌注损伤的心脏具有抗心律失常和心脏保护作用而受到了特别的研究关注（16）。PUFAs主要有两种类型：ω-3和ω-6。亚油酸（LA）和α-亚麻酸（ALA）分别是ω-6和ω-3脂肪酸的常见实例。迄今为止，大多数研究都集中在ω-3脂肪酸对心血管系统的影响上（4, 6, 13, 16, 17, 24）。富含ω-3脂肪酸（如鱼类）的饮食已一致显示出有益的心血管效应（5, 8, 12, 20, 23）。相比之下，关于ω-6脂肪酸作为心脏保护剂的研究较少。此外，关于ω-6脂肪酸摄入对心血管益处的研究也得出了相互矛盾的结果（2, 3, 7, 9, 19, 22）。几项研究已将脂肪组织中的LA含量与冠心病死亡风险降低（21）或心绞痛风险降低（26）相关联。LA还可能具有抗心律失常特性（27）。然而，其他研究（10）表明，LA在缺血期间对心脏有害，这导致有人建议应降低饮食中的LA含量以提供心脏保护效果。最近，一些研究提出，考虑饮食中ω-6与ω-3脂肪酸的比例很重要。西莫普洛斯（Simopoulos）（25）提出，与LA与ALA比例较低的饮食相比，LA与ALA比例较高（当前饮食中的比例为12–20:1）的饮食对心血管系统的影响更为有害。显然，需要更多信息来解决这一重要的饮食难题。火麻仁是一种独特的食物，可能为界定LA和ALA在心血管健康中的作用这一问题提供了一种新方法。火麻仁富含LA。火麻仁的脂质组成中约50%为LA。然而，火麻仁的独特之处在于其LA与ALA的比例理想（约为3:1）（2, 25）。因此，它代表了一种有趣的饮食干预手段，可用于调节体内的ω-3和ω-6脂肪酸含量。不幸的是，尽管火麻仁已被食用了数百年，但在经过同行评审的文献中，尚无研究探讨其健康相关益处。因此，本研究的目的是探讨长期饮食补充火麻仁是否能改变心脏对缺血-再灌注损伤的反应。我们假设，火麻仁中ω-3和ω-6脂肪酸的最佳浓度将在缺血-再灌注挑战期间发挥有益的心脏保护作用。本研究中动物伦理护理和治疗指南已获得曼尼托巴大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会的批准。雄性Sprague-Dawley大鼠被分为四组，分别喂食四种不同的饮食，持续12周。所有大鼠在开始指定饮食时体重均≥250克。在常规大鼠饲料中补充5%（5H）或10%（10H）的火麻仁，或1%的棕榈油[饱和脂肪（SF）饮食]。选择SF饮食是为了模拟补充10H饮食的脂肪含量。此外，棕榈油主要含有饱和脂肪酸，而非ω-3和ω-6脂肪酸。在本研究中，使用补充了10%去脂火麻仁（DLH）的常规大鼠饲料作为对照饮食。仅喂食常规大鼠饲料的大鼠不被视为合适的对照组，因为该饲料未像其他所有饮食那样进行补充。此外，它含有相当数量的ω-3和ω-6脂肪酸。饮食干预完成后，大鼠在摘除心脏进行体外灌注前，使用酮胺-甲苯噻嗪混合物进行麻醉。采用Langendorff逆行灌注技术（15），以10 ml/min的速度，在37°C、pH 7.4的条件下，用标准Krebs缓冲液对心脏进行灌注。如先前所述（18），使用与图表记录仪相连的力传感器记录心尖至心底的位移（收缩张力）。切除心房，并使用电极将心率维持在200次/分钟。通过关闭蠕动泵来诱导全局缺血。缺血诱导10分钟后，再进行45分钟的再灌注。通过以下参数评估心脏的收缩性能：发展张力、静息张力、张力发展及其消散（松弛）的速率（±dT/dt），以及期外收缩的发生率。血浆中的LA、ALA和γ-亚麻酸（GLA）水平通过气相色谱法测定。简而言之，使用含有EDTA的真空采血管收集血样。在4°C下，以1800 g的离心力离心血样5分钟，以获得血浆。将血浆分装至Eppendorf管中，并储存在-80°C下。然后，使用Lepage和Roy的方法（14）从血浆样本中提取脂肪酸并进行衍生化。使用配备火焰离子化检测器和Varian CP-Sil 88毛细管柱（60 m × 0.25 mm × 0.20 μm）的Varian CP-3800气相色谱仪进行检测。使用CP-8400自动进样器以1:50的分流比注入1微升的苯层。氦气载气的流速为1.5 ml/min。初始烘箱温度设定为80°C，并保持1分钟，然后以30°C/分钟的速度升至140°C，再以5°C/分钟的速度升至225°C，并保持10分钟。每个样本的总运行时间为30分钟。使用上述相同的衍生化技术和色谱参数检测心脏和饮食中的脂肪酸水平。然而，在此之前需要先使用Folch技术（1）进行脂质提取。通过与真实标准品GLC-462（Nu-Chek Prep，Elysian，MN）进行比较来鉴定样本中的脂肪酸含量。数据采用单因素方差分析测试，随后进行Duncan’s多重范围事后测试。统计显著性确定为P ≤ 0.05。![]()
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表2. 饲料中亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸的含量
动物体重。在研究过程中，大鼠的体重显著增加。研究开始时，大鼠的体重约为250克，经过12周的饮食干预后，DLH组、SF组、5H组和10H组的大鼠体重分别增长至613±17克、628±23克、644±19克和603±14克。12周后，四种不同饮食干预下的大鼠体重无显著差异。饮食组成。与对照组DLH饮食相比，由于加入了火麻仁或棕榈油（表1），实验饮食的营养组成仅在总脂肪含量上有所不同。饮食脂肪酸水平。与DLH组（0.64±0.02%）和火麻仁组（5H组：0.93±0.03%；10H组：0.72±0.02%）相比，SF组饮食中的饱和脂肪酸显著增加（2.71±0.03%）。与另外两种饮食相比，添加火麻仁的组中亚油酸（LA）和α-亚麻酸（ALA）的水平显著更高，且10H组显著高于5H组（表2）。尽管γ-亚麻酸（GLA）的水平与LA和ALA相比仅为微量，但在不同饮食组之间仍观察到了GLA水平的显著差异。仅10H组和SF组与DLH组有显著差异，而两个火麻仁组均与SF组有显著差异。此外，10H组的GLA水平显著高于5H组。SF组和DLH组之间也存在显著差异。与DLH组相比，SF组中的ALA和GLA水平显著降低，而LA水平无显著差异（表2）。血浆脂肪酸水平。在12周的饮食干预后，从大鼠体内采集血液，分离血浆并分析其脂肪酸组成。与另外两组相比，喂食5H或10H补充饮食的大鼠血浆中LA水平无显著差异（图1A）。与喂食SF和DLH饮食的大鼠相比，喂食5H和10H补充饮食的大鼠血浆中ALA和GLA水平显著升高（图1B和C）。此外，10H补充组大鼠的血浆ALA水平显著高于5H补充组（P<0.05）。SF组和DLH组之间在这两种脂肪酸上无统计学显著差异。其他生理上重要的脂肪酸种类，如二十碳五烯酸（EPA, 20:5n-3）和二十二碳六烯酸（DHA, 22:6n-3），未受饮食干预的影响（数据未显示）。心脏组织脂肪酸水平。与DLH组和喂食火麻仁补充饮食的大鼠相比，喂食SF饮食的大鼠心脏中LA水平无显著差异（图2A）。然而，在12周饮食干预结束时，与DLH组和SF组相比，喂食5H和10H补充饮食的大鼠心脏中ALA浓度存在显著差异（图2B）。此外，10H补充组心脏中的ALA水平显著高于5H处理组。所有组中GLA的浓度均低于检测水平。EPA和DHA未受饮食干预的影响（数据未显示）。缺血-再灌注期间的心脏功能。经过12周的饮食管理后，心脏对缺血-再灌注损伤的反应发生了显著变化。如图3所示，缺血导致所有组心脏的发育张力显著丧失。再灌注后，发育张力立即恢复。在所有组中，这种恢复在再灌注后20-30分钟内趋于稳定。在喂食去脂火麻仁饮食的对照组大鼠中，再灌注前35分钟内发育张力未恢复。在再灌注40分钟时，检测到约5%的张力恢复，这与其他组形成鲜明对比。在再灌注期间，与去脂火麻仁组相比，喂食火麻仁补充饮食的组发育张力的恢复显著更好。10H补充组倾向于表现出最佳的恢复，但这与5H补充组无统计学差异。喂食SF饮食的大鼠在再灌注期间心脏发育张力的恢复显著较慢，且发育张力的最大恢复程度也较低。![]()
图1. 大鼠食用12周含有5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、1%饱和脂肪（SF）或10%去脂火麻仁（DLH）的标准饲料后，血浆中亚油酸（LA；A）、α-亚麻酸（ALA；B）和γ-亚麻酸（GLA；C）的浓度。数值为平均值±标准误（SE）。*与对照组有显著差异；†与SF组有显著差异；‡与5H组有显著差异（P < 0.05；n = 6-10）。
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图2. 大鼠食用为期12周、分别补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料后，其心脏组织中亚油酸（LA；A）和α-亚麻酸（ALA；B）的浓度。数值表示为平均值±标准误（SE）。*表示与对照组有显著差异；†表示与SF组有显著差异；‡表示与5H组有显著差异（P < 0.05；n = 6~10）。FAME，脂肪酸甲酯。
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图3. 食用补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料的大鼠，在缺血前、缺血期间和缺血后的心脏发育张力。数值表示为平均值±标准误（SE）。*与对照组有显著差异；†与SF组有显著差异（P < 0.05；n = 6~10）。
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图4. 食用补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料的大鼠，在缺血前、缺血期间和缺血后的心脏发育张力变化率（dT/dt）。数值表示为平均值±标准误（SE）。*与对照组有显著差异（P < 0.05；n = 6~10）。
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图5. 食用补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料的大鼠，在缺血前、缺血期间和缺血后的心脏舒张速率（-dT/dt）。数值表示为平均值±标准误（SE）。*与对照组有显著差异（P < 0.05；n = 6~10）。
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图6. 食用补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料的大鼠，在缺血前、缺血期间和缺血后的心脏静息张力。数值表示为平均值±标准误（SE）（P ≥ 0.05；n = 6~10）。缺血导致所有组别心脏的张力发展速率（图4）及其消散（舒张）速率（图5）均显著下降。再灌注促进了心脏张力产生和舒张的恢复。从定性角度来看，这些收缩参数的反应与观察到的最大发育张力的反应相似。食用去脂火麻仁（DLH）饲料的大鼠在再灌注40分钟后才表现出张力发展速率（ dT/dt）和舒张速率（dT/dt）的轻微恢复。相比之下，与对照组和去脂火麻仁补充组相比，火麻仁补充组在再灌注15分钟后，张力发展速率和舒张速率均显著增加。食用10%火麻仁（10H）补充饲料的大鼠表现出最佳的恢复效果，但这与食用5%火麻仁（5H）补充饲料的大鼠所得数值无统计学差异。同样，与食用火麻仁饲料的大鼠相比，食用饱和脂肪（SF）补充饲料的大鼠的张力发展速率和舒张速率的恢复均较慢。缺血导致所有检查的心脏的静息张力略有增加（图6）。再灌注则导致静息张力立即大幅上升。静息张力增加至缺血前数值的约180%，并随着再灌注时间的推移逐渐消散。在缺血期间或再灌注期间检查的任何时间点，各饮食干预组之间静息张力的增加均无统计学显著差异（P < 0.05）。在缺血前用正常灌注液灌注的心脏中很少观察到期外收缩，而缺血时观察到了心律失常的证据，表现为期外收缩。在诱导缺血时，期外收缩也不常见（图7）。在缺血期间，各组之间期外收缩的发生率无显著差异。与缺血期相比，再灌注期间期外收缩的发生率增加，但各组之间的发生率无差异。![]()
图7. 食用补充了5%火麻仁（5H）、10%火麻仁（10H）、饱和脂肪（SF）或去脂火麻仁（DLH）的标准饲料的大鼠，在缺血前、缺血期间和缺血后期外收缩的发生率。数值表示为平均值±标准误（SE）（*P ≥ 0.05；n = 6~10）。亚麻酸（LA）是一种ω-6脂肪酸，在火麻仁中含量丰富。然而，5%火麻仁（5H）和10%火麻仁（10H）的补充并不足以有效提升这些大鼠的血浆LA水平。鉴于火麻仁中LA的含量，这一结果令人惊讶。但这也并非完全出乎意料，因为一项临床研究（11）中也观察到了类似的结果，在该研究中，受试者连续3个月摄入火麻仁油胶囊，但尽管摄入了LA，其血浆LA含量并未发生显著变化。有研究表明（11），LA的吸收效率低于其他脂肪酸，而本研究的数据也将这一结论扩展到了大鼠身上。火麻仁中还富含（尽管程度较低）ω-3脂肪酸，即α-亚麻酸（ALA）和γ-亚麻酸（GLA）。喂食富含火麻仁饲料的大鼠血浆中ALA和GLA水平有所升高。因此，尽管火麻仁中ω-6脂肪酸含量更高，但我们的饮食干预却导致大鼠对ω-3脂肪酸的选择性吸收超过ω-6脂肪酸。血浆中ALA和GLA的增加特定于火麻仁补充组。而喂食去脂火麻仁和棕榈油补充饲料的大鼠，其血浆中ALA或GLA水平并未增加。这些血浆脂肪酸含量的增加仅在ALA的情况下被转移到心脏组织中。火麻仁饮食补充后，心脏组织中ALA水平升高。据我们所知，这是首份报告指出，通过火麻仁饮食补充，这些ω-3脂肪酸能有效吸收并选择性沉积于心脏中。由于本研究使用离体心脏来评估缺血-再灌注期间的心脏功能，因此消除了体内观察到的高循环ALA水平的影响。因此，饮食的保护作用可能主要依赖于心脏组织本身的变化。当然，我们不能排除心脏血管变化可能与观察到的效应有关的可能性。也有可能这些ALA的变化并不是直接导致观察到的效应的原因，而是可能诱导了另一种信号分子的产生，该分子本身才是产生有益作用的原因。然而，我们认为仍然可以从我们的工作中得出两个一般性的结论。首先，很明显，任何心脏保护作用都是由于心脏内源性的ALA储备，而其他未受火麻仁饮食影响的脂肪酸（包括LA、GLA、EPA和DHA）并不参与这一作用。其次，由于循环和心脏组织内源性ALA储备的存在，火麻仁饮食的心脏保护作用在体内可能更为显著。因此，本研究可能低估了火麻仁饮食补充在心脏缺血-再灌注挑战中的心脏保护作用。本研究首次证明，火麻仁饮食是一种有效且独特的方法，可以显著改变心脏中ALA的水平。我们还首次证明，火麻仁饮食将对经历缺血-再灌注挑战的心脏产生有益的心脏保护作用。由于ALA是火麻仁补充后心脏中唯一改变的脂肪酸，因此很明显，这种有益作用是由ALA诱导的。这扩展了Pepe和McLennan（20）的数据，他们表明鱼油可以改善心脏缺血后的收缩功能恢复。在他们的研究中，EPA和DHA被认为是鱼油发挥作用的主要机制。我们的研究是首个证明通过ALA，火麻仁饮食也可以对缺血后的心脏产生心脏保护作用的研究。其他ALA的来源包括亚麻籽、芥花籽油、大豆、核桃和一些鱼类如鲑鱼（20）。由于大鼠食用火麻仁后LA水平并未增加，因此本研究无法解决当前文献中关于LA和ω-6脂肪酸对心血管有负面影响的普遍争议。本研究的一个潜在局限性是心脏未进行血液灌注，因此避免了LA可能通过刺激血小板聚集等机制产生的任何副作用。然而，初步数据（未显示）表明，火麻仁饮食可抑制血小板聚集，因此血液灌注不太可能揭示任何副作用。尽管火麻仁在饮食中有着悠久的历史，但在同行评审的文献中，关于其生物效应的数据却很少。本研究中使用的最高浓度的火麻仁补充量为10%。在没有关于火麻仁的临床研究的情况下，很难将其与人类摄入火麻仁的水平联系起来。然而，我们相信本研究中选择的5%~10%的火麻仁补充水平与人类饮食具有相关性。类似水平的亚麻籽（10%）补充被认为可以充分模拟人类的饮食干预（1）。这可能代表了饮食中一个因依从性问题而设定的上限。饮食中更高浓度的火麻仁可能并不实际。然而，鉴于火麻仁的摄入已有数百年的历史，严重的并发症可能并不是一个现实的问题。在没有对人类进行详细研究的情况下，这目前仅仅是推测。需要进一步在动物和人体试验中进行研究。
