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在台湾，蓟属（菊科）植物被用作传统保肝药物。本研究收集了四种蓟属植物，包括阿里山蓟（Cirsium arisanense，CAH）的地上部分、川岛蓟（Cirsium kawakamii，CKH）的地上部分、日本蓟南方变种（Cirsium japonicum DC. var. australe，CJF）的花部以及小蓟（Cirsii Herba，CH），并使用70%甲醇进行提取。我们通过分光光度法和高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（High-Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector，HPLC-DAD）比较了这四种蓟属植物提取物的抗氧化成分及活性。此外，我们还评估了这些提取物对四氯化碳（CCl₄）诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤的保肝作用。研究发现，在四种蓟属植物中，CAH的抗氧化活性最高，且这些抗氧化活性与苯丙素苷（Phenylpropanoid Glycoside，PPG）含量密切相关。提取物降低了由0.2% CCl₄注射引起的血清丙氨酸转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）水平升高。然而，只有CJF和CH能够减轻肝坏死。水飞蓟宾降低了CCl₄引起的血清ALT和AST水平升高以及肝坏死。CJF和CH恢复了肝抗氧化酶的活性，并降低了肝丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。CJF还进一步恢复了肝抗氧化酶的表达，包括铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-Superoxide Dismutase，Cu/Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-Superoxide Dismutase，Mn-SOD）和谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-Transferase，GST）蛋白。HPLC色谱图显示，CKH、CJF和CH含有水飞蓟宾差向异构体（α和β）。仅CJF含有二氢黄酮。因此，CJF对CCl₄诱导的急性肝损伤的保肝机制可能涉及恢复肝抗氧化防御系统的活性和蛋白表达，以及抑制肝炎症，这些保肝作用与水飞蓟宾差向异构体和二氢黄酮的含量有关。肝脏是一个辅助消化腺，在脊椎动物体的代谢、解毒和分泌功能中发挥着关键作用。多种病毒、药物和有毒化学物质可通过其直接毒性作用和/或代谢毒性产物引起肝脏损伤。药物性肝损害占所有住院病例的5%，且50%的急性肝衰竭患者均由此受累[1]。已知四氯化碳（CCl₄）可在体内外引起肝脏损伤和肝细胞凋亡/坏死[2,3,4,5]。CCl₄所致肝损伤是评估许多保肝药物疗效的常用模型[6]。CCl₄经肝细胞色素P450 2E1（CYP2E1）转化为高活性自由基，如三氯甲基（CCl3•）自由基和三氯甲基过氧自由基（CCl3OO•）[7]。随后，这些自由基攻击细胞大分子，引起脂质过氧化、蛋白质降解和DNA损伤。此过程伴随着肝炎性细胞因子（如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））的释放，最终导致包括肝细胞坏死在内的损伤[2,4,7]。小蓟（Cirsii Herba，CH）收录于《中国药典》，在传统中药材市场上常与日本蓟（Cirsium japonicum DC）和蓟（Cirsium setosum (Willd.) MB）混淆，因为它们在形态和分类上相似。中医常用小蓟治疗出血、高血压和肝炎。近期药理学报告显示，小蓟具有止血、保肝、抗糖尿病、抗炎、抗菌和镇静等多种药理活性[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。由于其分类（菊科）和形态与水飞蓟（Silybum marianum (L.) Gaertn.）相似，蓟属通常被称为蓟类植物，并已被用于治疗炎症、糖尿病和肝炎。水飞蓟长期以来一直用于保护由化学和环境毒素引起的肝损伤。水飞蓟的主要活性成分水飞蓟素包括黄酮木质素异构体：50%~70%的水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟啶[17,18]。水飞蓟素还对酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病和CCl₄诱导的肝损伤具有保肝作用[11,19,20]。台湾植物志中描述了蓟属的10个物种[21]，其中阿里山蓟（Cirsium arisanense Kitam.，CA）、川岛蓟（Cirsium kawakamii Hayata，CK）和日本蓟南方变种（Cirsium japonicum DC. var. australe Kitam.，CJ）被称为“台湾蓟”，在台湾常作为民间药物使用。然而，关于这三种台湾特有蓟属植物的植物成分和保肝活性的科学研究报道甚少。因此，本研究比较了四种蓟属植物提取物对体外ABTS（2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基的抗氧化活性，以及它们对CCl₄诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤的保肝作用。以水飞蓟的主要成分水飞蓟素和水飞蓟宾（最常用的保肝药物）作为阳性对照。此外，还研究了其保肝作用的机制，涉及其潜在的抗氧化和抗炎特性。此外，以往的植物化学研究表明，小蓟中含有黄酮类、木质素类、苯丙素类、三萜类、挥发油和甾体类成分，尤其是黄酮类成分[11,12,22,23,24,25]。因此，本研究还通过分光光度法和高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-DAD）比较了四种蓟属植物的植物成分。2.1. CCl₄诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤2.1.1. CCl₄诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤血清生化指标血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平被用作急性肝损伤的生物化学标志物。与对照组相比，单次给予0.2% CCl₄后，C57BL/6小鼠血清ALT和AST水平显著升高（p < 0.001）（图1）。预先连续7天给予所有剂量的四种蓟属植物提取物均能显著抑制0.2% CCl₄引起的血清ALT和AST水平升高（p < 0.001）（图1）。阳性对照水飞蓟宾（25 mg/kg剂量）也能防止血清ALT和AST水平升高，但阳性对照水飞蓟素（100 mg/kg剂量）仅能防止血清ALT水平升高（p < 0.001）（图1）。![]()
图1. 四种蓟属植物甲醇提取物（0.5、5、50 mg/kg）、水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导的急性肝损伤血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的影响。（A）ALT；（B）AST。CAH：C. arisanense Kitam的地上部分。CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分。CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam的花部。CH：蓟草。连续7天给药CAH-L、CAH-H、CKH-L、CKH-H、CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。柱形图表示平均值±标准误（n = 10）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，*** p < 0.001。
2.1.2. C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤的肝脏组织病理学肝脏组织病理学为血清生化分析提供了佐证。对照组的肝脏组织病理学显示肝细胞正常（图2A）。单次给予0.2% CCl4导致C57BL/6小鼠肝脏结构丧失，包括空泡形成、炎性浸润和坏死（图2B）。水飞蓟宾、CJF和CH对CCl4诱导的组织学改变有不同程度的改善作用（图2C-H）。单次给予0.2% CCl4后，肝细胞坏死水平显著升高（p < 0.001）（图2I）。仅CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H能抑制CCl4诱导的肝损伤现象（p分别< 0.05、0.001、0.01、0.001）（图2I）。水飞蓟素、CAH和CKH未能降低CCl4诱导的肝细胞坏死水平（p > 0.05）（图2I）。图2. 四种蓟属植物甲醇提取物（0.5、5、50 mg/kg）、水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤肝脏组织病理学的影响。（A）对照组的苏木精和伊红（H&E）染色；（B）CCl4组的H&E染色；（C）水飞蓟素组的H&E染色；（D）水飞蓟宾组的H&E染色；（E）CAH-H组的H&E染色；（F）CKH-H组的H&E染色；（G）CJF-H组的H&E染色；（H）CH-H组的H&E染色；（I）坏死程度。CAH：C. arisanense Kitam的地上部分。CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分。CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam的花部。CH：蓟草。连续7天给药CAH-L、CAH-H、CKH-L、CKH-H、CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。图像（A-H）为400倍放大下的H&E染色代表性图片。黑色箭头指示肝细胞坏死。柱形图（I）表示平均值±标准误（n = 10）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。2.1.3. C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤的肝脏抗氧化活性及丙二醛（MDA）水平为阐明四种蓟属植物提取物通过抗氧化防御系统对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤的保护作用，我们测定了肝脏抗氧化防御系统的活性，包括谷胱甘肽（GSH）水平、相关抗氧化酶的活性以及氧化损伤标志物如丙二醛（MDA）的水平。单次腹腔注射0.2% CCl4可降低大鼠肝脏抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化氢酶（p < 0.001）（图3）。我们进一步发现，单次腹腔注射0.2% CCl4还可降低C57BL/6小鼠肝脏GSH水平，但增加肝脏MDA水平（p < 0.001）（图4）。CAH-L和CAH-H可恢复肝脏SOD和过氧化氢酶活性，并降低肝脏MDA水平（p < 0.01, 0.001），但仅CAH-H能恢复肝脏GPx和GR活性（p < 0.05）（图3和图4）。仅CKH-H能恢复肝脏SOD和GR活性以及GSH水平（p < 0.05, 0.001），但CKH-L和CKH-H均可降低肝脏MDA水平（p < 0.001）（图3和图4）。CJF-L和CJF-H可恢复肝脏GPx、GR和SOD活性，并降低肝脏MDA水平，但仅CJF-H能恢复肝脏过氧化氢酶活性和GSH水平（p < 0.001）（图3和图4）。仅CH-H能恢复所有肝脏抗氧化酶的活性（p < 0.05, 0.001），但CH-L和CH-H均可降低肝脏MDA水平（p < 0.001）（图3和图4）。水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）可恢复所有肝脏抗氧化酶的活性，并降低肝脏MDA水平（p < 0.01, 0.001）（图3和图4）。然而，仅水飞蓟宾能恢复CCl4降低的肝脏GSH水平（p < 0.05）（图4）。![]()
图3. 四种蓟属植物甲醇提取物（0.5、5、50 mg/kg）、水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤肝脏抗氧化酶活性的影响。（A）谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）；（B）谷胱甘肽还原酶（GR）；（C）超氧化物歧化酶（SOD）；（D）过氧化氢酶。CAH：C. arisanense Kitam的地上部分。CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分。CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam的花部。CH：蓟草。连续7天给药CAH-L、CAH-H、CKH-L、CKH-H、CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。柱形图表示平均值±标准误（n = 10）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。图4. 四种蓟属植物甲醇提取物（0.5、5、50 mg/kg）、水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤肝脏谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平的影响。（A）GSH；（B）MDA。TBARS：硫代巴比妥酸反应物。CAH：C. arisanense Kitam的地上部分。CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分。CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam的花部。CH：蓟草。连续7天给药CAH-L、CAH-H、CKH-L、CKH-H、CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。柱形图表示平均值±标准误（n = 10）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，* p < 0.05，*** p < 0.001。2.1.4. C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤的肝脏细胞因子水平为阐明四种蓟属植物提取物对C57BL/6J小鼠CCl4诱导急性肝损伤的保护作用的抗炎机制，我们测定了肝脏细胞因子水平，包括白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。单次腹腔注射0.2% CCl4可提高C57BL/6小鼠的肝脏细胞因子水平（p < 0.001）（图5）。CAH、CJF和CH-H可降低肝脏IL-1β水平（p < 0.001）（图5）。仅CJF-H可降低肝脏TNF-α水平（p < 0.001）（图5）。水飞蓟宾（25 mg/kg）可降低肝脏IL-1β水平（p < 0.001）（图5）。然而，水飞蓟素（100 mg/kg）和CKH并未降低CCl4升高的肝脏细胞因子水平（p > 0.05）（图5）。图5. 四种蓟属植物甲醇提取物（0.5、5、50 mg/kg）、水飞蓟素（100 mg/kg）和水飞蓟宾（25 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤肝脏细胞因子水平的影响。（A）白介素-1β（IL-1β）；（B）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。CAH：C. arisanense Kitam的地上部分。CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分。CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam的花部。CH：蓟草。连续7天给药CAH-L、CAH-H、CKH-L、CKH-H、CJF-L、CJF-H、CH-L和CH-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。柱形图表示平均值±标准误（n = 10）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，*** p < 0.001。2.1.5. C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤的抗氧化蛋白表达蛋白质免疫印迹分析如图6A所示。单次腹腔注射0.2% CCl4可降低C57BL/6小鼠肝脏谷胱甘肽硫转移酶（GST）、铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的表达水平（p < 0.05, 0.01）（图6B-D）。仅CJF-H可恢复由CCl4下调的肝脏GST、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达水平（分别p < 0.05, 0.01）（图6B-D）。图6. C. japonicum DC. var. australe Kitam花部甲醇提取物（CJF；0.5、5 mg/kg）对C57BL/6小鼠CCl4诱导急性肝损伤GST、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达的影响。（A）Western blot；（B）GST；（C）Cu/Zn-SOD；（D）Mn-SOD。连续7天给药CJF-L和CJF-H。最后一次给药后1小时，通过注射0.2% CCl4诱导急性肝损伤。柱形图表示平均值±标准误（n = 4）。与CCl4诱导的急性肝损伤小鼠相比，* p < 0.05，** p < 0.01。2.2. 四种蓟属植物提取物的抗氧化成分含量及活性2.2.1. 四种蓟属植物提取物的总酚（TPs）含量、总苯丙素苷（PPGs）含量及高效液相色谱（HPLC）分析四种蓟属植物提取物的TPs和PPGs含量如表1所示。与其他三种蓟属植物提取物相比，CAH中的TPs和PPGs含量较高。其他三种蓟属植物提取物中TPs含量的顺序为CKH > CJF > CH。然而，其他三种蓟属植物提取物中PPGs含量的顺序为CJF > CH > CKH。此外，使用HPLC对四种蓟属植物提取物的植物成分进行了测定。其色谱图如图7所示。四种蓟属植物提取物的特定植物成分峰区存在差异。芹菜素、二氢黄酮、水飞蓟宾α、水飞蓟宾β、水飞蓟宁、水飞蓟亭、异水飞蓟宾α和异水飞蓟宾β的校准曲线在2.520 μg/mL浓度范围内绘制。校准图的相关系数为0.9920.994，表明在四种情况下均具有良好的线性关系。四种蓟属植物的甲醇提取物均含有水飞蓟宾α，且CAH中的含量最高。CKH、CJF和CH含有水飞蓟宾β。仅CAH和CJF含有水飞蓟宁。二氢黄酮仅存在于CJF中（表1）。![]()
图7. 四种蓟属植物甲醇提取物在280纳米下的高效液相色谱（HPLC）色谱图。图谱依次为：（A）标准品，（B）CAH：C. arisanense Kitam.的地上部分，（C）CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分，（D）CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam.的花部，（E）CH：Cirsii Herba。Trolox当量抗氧化能力（TEAC）测定法是一种简单快速的方法，常用于评估与清除2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基和体外活性氧物种（ROS）相关的总抗氧化能力。四种蓟属植物提取物在TEAC测定中的总抗氧化能力如图8A所示，并以Trolox当量（mmol Trolox/g样品）表示。与其他三种蓟属植物相比，CAH对ABTS自由基的抗氧化能力最高。随后，我们通过Pearson相关分析进一步研究了TEAC与抗氧化植物成分含量之间的关系。结果显示，仅有PPGs含量与TEAC呈正相关且高度相关（r = 0.99）（图8B）。图8. 四种蓟属植物甲醇提取物的抗氧化活性。（A）Trolox当量抗氧化能力（TEAC）；（B）TEAC与PPGs含量的关系。柱形图表示平均值±标准差（n=3）。CAH：C. arisanense Kitam.的地上部分；CKH：C. kawakamii Hayata的地上部分；CJF：C. japonicum DC. var. australe Kitam.的花部；CH：Cirsii Herba。基于分类学、形态学和民间药用情况，蓟属与水飞蓟（Silybum marianum (L.) Gaertn）相似。它们通常被称为蓟，并已被用于治疗炎症和肝炎。水飞蓟及其成分水飞蓟素对酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病和CCl4诱导的肝损伤具有保肝作用[11,19,20]。CCl4是最古老且使用最广泛的肝毒素，在啮齿动物中单次注射CCl4常被用作筛选保肝药物的急性肝损伤模型[6]。CCl4诱导的肝损伤主要是由于CCl4代谢产物衍生的自由基引起的肝细胞膜脂质过氧化。肝细胞膜的破坏导致肝酶如ALT和AST释放到血液循环中。因此，血清ALT和AST水平被用作肝损伤的生物化学标志物[26]。在本研究中，使用急性CCl4肝损伤模型来比较四种蓟属植物提取物的保肝效果，以水飞蓟素和水飞蓟宾作为阳性对照。我们发现，在C57BL/6小鼠中，单次注射CCl4后，血清ALT和AST水平显著升高，表明CCl4诱导了急性肝损伤。本研究结果表明，四种蓟属植物提取物中的任何一种剂量均可降低CCl4升高的血清ALT和AST水平。此外，通过肝脏组织病理学染色进行的血清生化分析发现，CCl4导致C57BL/6小鼠肝细胞结构功能障碍，包括空泡形成、炎性浸润和坏死。然而，与CCl4组相比，仅CJF和CH（任何剂量）以及水飞蓟宾预处理7天后，对CCl4诱导的急性肝损伤表现出肝细胞结构破坏最小且坏死较少。先前的研究报道表明，CH（C. japonicum DC或C. setosum）对CCl4诱导的L02细胞或HL-7702细胞肝毒性具有保肝作用[11,12]。Ku等人报道，CA的根部（而非地上部分）对Hep 3B细胞和C57BL/6小鼠中他克林诱导的肝毒性具有保肝作用[27]。因此，我们目前的血清生化和组织病理学数据表明，在四种蓟属植物中，只有CJF和CH对CCl4诱导的急性肝损伤具有令人信服的保肝效果，尽管所有四种地方性蓟属植物都降低了血清ALT和AST水平。两个阳性对照，水飞蓟素和水飞蓟宾，均可降低CCl4升高的血清ALT和AST水平，但只有水飞蓟宾能够预防肝细胞结构功能障碍。Wu等人指出，水飞蓟素并未降低CCl4引起的小鼠血清ALT和AST水平以及组织病理学改变[28]，尽管许多研究发现，200–800 mg/kg的水飞蓟素可减轻由乙酰氨基酚、乙醇和CCl4引起的肝损伤[29,30,31]。因此，我们的结果证实了其他报道[32]，即水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性成分，且在20–50 mg/kg的剂量下可预防由乙酰氨基酚、乙醇和CCl4引起的肝损伤。实验和临床报告表明，氧化应激在药物性肝损伤的发展中起着关键作用[33]。CCl4诱导的肝损伤主要是由于CYP2E1对CCl4去卤化产生的反应性自由基。这些反应性自由基，包括三氯甲基自由基（CCl3•）和三氯甲基过氧自由基（CCl3OO•），会导致肝脏抗氧化状态耗竭和肝脏脂质过氧化加剧[7]。肝脏对抗自由基的主要抗氧化防御系统包括SOD、过氧化氢酶和GSH氧化还原循环。SOD是抗氧化防御系统中涉及的第一种酶，可清除由线粒体电子传递链产生的超氧阴离子。当SOD将超氧阴离子转化为H2O2时，过氧化氢酶会连续将其解毒为H2O。GSH氧化还原循环主要包括GSH、GPx和GR，可调节由外部或细胞内刺激诱导的肝细胞氧化还原介导的反应。GSH是一种胞质三肽，是细胞内氧化还原稳态的主要非酶调节剂。GSH可直接清除羟自由基，并作为解毒酶GPx催化解毒过氧化氢、脂质过氧化物和烷基过氧化物的辅因子。GPx是一种含硒半胱氨酸的酶，可将肝脏中的脂质过氧化物还原为相应的醇，并将过氧化氢还原为水。GR对于谷胱甘肽氧化还原循环至关重要，可维持足够的还原型细胞GSH水平，催化氧化型GSH还原为还原型GSH。在这方面，增强肝脏抗氧化系统能力可能是缓解和治疗肝损伤的有效治疗策略[33,34]。我们的数据显示，单次注射CCl4导致肝脏匀浆中GSH水平显著耗竭，SOD、过氧化氢酶、GR和GPX功能失调，并增强了脂质过氧化。因此，结果证实CCl4降低了抗氧化酶的功能和GSH氧化还原循环，从而改变了细胞内氧化还原状态，导致氧化应激并增强了肝脏中的脂质过氧化。在这里，我们的结果表明，CJF或水飞蓟宾预处理7天可显著恢复GSH水平和抗氧化酶（包括SOD、过氧化氢酶、GPx和GR）的活性，并降低小鼠肝脏匀浆中的MDA水平。CH预处理也可恢复抗氧化酶的活性，但不能恢复GSH氧化还原循环。然而，CH仍然降低了肝脏MDA水平。先前的研究表明，C. japonicum DC可降低乙醇处理大鼠的肝脏脂质过氧化，同时增加肝脏还原型谷胱甘肽的含量。与水飞蓟宾类似，CJF可能在恢复肝脏氧化还原能力和抗氧化酶活性方面发挥作用，从而对CCl4诱导的急性肝损伤产生保护作用。其他蓟属植物在恢复肝脏氧化还原能力和抗氧化酶活性以对抗CCl4诱导的急性肝损伤方面并不如此全面。此外，GST是一种II期代谢酶。它可增加细胞GSH水平，并通过将自由基与GSH结合来保护细胞免受氧化应激[35]。在哺乳动物中，SOD由三种同工酶组成：胞质Cu/Zn-SOD（SOD1）、线粒体Mn-SOD（SOD2）和胞外Cu/Zn-SOD（SOD3）。Cu/Zn-SOD（SOD1）主要定位于胞质中，一小部分定位于线粒体的膜间隙。Cu/Zn-SOD（SOD1）占总SOD的90%，具有重要的生理意义和治疗潜力。Mn-SOD是一种含锰（Mn）的酶，定位于线粒体基质中。Mn-SOD的主要作用是维持线粒体功能[36]。因此，我们进一步探讨了GST、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白在CJF对C57BL/6小鼠CCl4诱导的急性肝损伤的保肝作用中的机制。CCl4降低了肝脏匀浆中GST、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白的表达。高剂量的CJF可恢复CCl4下调的GST、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白的表达。因此，CJF的保肝机制与通过逆转GSH氧化还原循环以及抗氧化酶的活性和表达来恢复肝脏抗氧化防御系统的活性有关。在CCl4诱导的急性肝损伤病理过程中，炎症过程起着至关重要的作用。肝脏中的常驻巨噬细胞，即Kupffer细胞，被激活并迅速释放促炎细胞因子，如TNF-α和IL-1β。这些促炎细胞因子在调节炎症反应的复杂网络中发挥着重要作用。TNF-α和IL-1β水平的增加与肝坏死的组织病理学证据以及血清ALT和AST水平的增加相关。因此，抑制巨噬细胞活性和促炎细胞因子的释放为缓解肝脏炎症和损伤提供了极佳的治疗策略[37]。此外，我们还研究了四种蓟属植物对CCl4诱导的急性肝损伤中肝脏促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）水平的影响。本研究证实，CCl4给药导致C57BL/6小鼠肝脏TNF-α和IL-1β水平增加。只有CJF显著降低了CCl4引起的小鼠肝脏匀浆中TNF-α和IL-1β水平的增加。CH和水飞蓟宾仅降低了CCl4引起的高IL-1β水平。因此，目前的结果表明，CJF通过逆转肝脏抗氧化防御系统和抑制促炎细胞因子表达，发挥其抗氧化和抗炎特性，对CCl4诱导的急性肝损伤具有保肝作用。最后，我们比较了四种蓟属植物的体外抗氧化活性和成分含量，因为它们的保肝作用部分与其抗氧化活性相关。在本研究中，CAH对ABTS自由基的清除活性最高。同时，CAH的总多酚（TPs）和聚苯乙烯苷（PPGs）含量也最高。根据皮尔逊相关分析，抗氧化（清除ABTS自由基）活性与PPGs含量之间存在密切相关性。然而，这一结果与保肝作用结果不一致。我们进一步通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析了四种蓟属植物的植物化学成分。四种蓟属植物的HPLC指纹图谱各不相同，可据此对它们进行区分。CKH、CJF和CH含有水飞蓟宾二立体异构体（α和β），其含量顺序为CKH > CJF > CH。CJF还含有西利地安和橙皮素。而CAH仅含有西利地安和水飞蓟宾α，与其他报道中称CAH中不存在相关化合物的说法不一致[27]。本研究首次报道了关于CAH、CKH和CJF的植物化学成分的结果。关于CH的植物化学成分的结果与其他报道一致[11]。然而，我们发现水飞蓟宾二立体异构体可能不是CKH、CJF和CH中发挥保肝作用（抵抗CCl4引起的肝损伤）的有效成分，因为水飞蓟宾二立体异构体的含量与保肝活性之间不存在相关性。CH的保肝植物化学成分可能包括黄酮类化合物，如水飞蓟宾二立体异构体和苯乙醇苷，因为C. japonicum的保肝成分是黄酮类化合物，而C. setosum的保肝成分是苯乙醇苷[11,12]。在四种蓟属植物中，CJF的保肝效果最好，其功效可能归因于水飞蓟宾二立体异构体和橙皮素，因为橙皮素可以抑制细胞色素P450 2E1（CYP 2E1）[38]，并且对内毒素诱导的急性肝损伤具有抗氧化和抗炎作用[39]。因此，必须明确CH对CCl4诱导的急性肝损伤的保肝植物化学成分。未来值得进一步研究水飞蓟宾二立体异构体和橙皮素对CCl4诱导的急性肝损伤的协同作用。此外，还需研究CJF对CCl4诱导的肝硬化的保肝作用。4.1 植物材料的采集与制备三种蓟属植物材料，包括CA的地上部分（CAH）、CK的地上部分（CKH）和CJ的花部（CJF），由Hung-Chi Chang鉴定并提供。CH购自中国台湾台中市中国医药大学的草药园。四种蓟属植物材料均用10倍体积的70%甲醇提取，所得提取物在减压下浓缩，得到四种蓟属植物的甲醇提取物。为评估植物化学成分和活性氧清除活性，将提取物溶解于蒸馏水中。为比较对CCl4诱导的急性肝损伤的保肝作用，将四种蓟属植物的甲醇提取物用0.5%羧甲基纤维素（CMC）制备。4.2. CCl4诱导的C57BL/6小鼠急性肝损伤模型4.2.1. 实验动物雄性C57BL/6小鼠（20–25 g）购自BioLASCO Taiwan Co., Ltd.。它们被随机分成六只一组，饲养在铁丝网笼（39 cm × 26 cm × 21 cm）中，环境温度控制在23 ± 1 °C，湿度为60%，光照周期为12小时光照（上午8:00至晚上8:00）和12小时黑暗。本研究方案（编号：CMUIACUC-2017392）已获得中国医药大学机构动物护理与使用委员会的批准，并按照《实验动物护理与使用指导原则》对小鼠进行照料。经过一周的适应期后，小鼠用于CCl4诱导的急性肝损伤实验。4.2.2. CCl4诱导C57BL/6小鼠急性肝损伤将小鼠随机分为12组，每组10只。对照组和CCl4组小鼠每日口服0.5%羧甲基纤维素（CMC）（0.1 mL/10 g体重），持续7天。在治疗组中，其余小鼠被分为10组：（1）CCl4 + 水飞蓟素：作为阳性对照，小鼠每日口服水飞蓟素（100 mg/kg），持续7天；（2）CCl4 + 水飞蓟宾：同样作为阳性对照，小鼠每日口服水飞蓟宾（25 mg/kg），持续7天；（3）CCl4 + CAH-L：小鼠每日口服CAH-L（5 mg/kg），持续7天；（4）CCl4 + CAH-H：小鼠每日口服CAH-H（50 mg/kg），持续7天；（5）CCl4 + CKH-L：小鼠每日口服CKH-L（5 mg/kg），持续7天；（6）CCl4 + CKH-H：小鼠每日口服CKH-H（50 mg/kg），持续7天；（7）CCl4 + CJF-L：小鼠每日口服CJF-L（0.5 mg/kg），持续7天；（8）CCl4 + CJF-H：小鼠每日口服CJF-H（5 mg/kg），持续7天；（9）CCl4 + CH-L：小鼠每日口服CH-L（5 mg/kg），持续7天；（10）CCl4 + CH-H：小鼠每日口服CH-H（50 mg/kg），持续7天。在第七天，除对照组外，所有小鼠在最后一次给药后1小时腹腔注射0.2% CCl4（溶于橄榄油中，0.1 mL/10 g体重），而对照组则注射橄榄油[40]。所有小鼠禁食24小时，随后在异氟烷麻醉下通过眼眶后静脉丛采血。然后，处死所有小鼠，解剖肝脏，用于组织病理学（甲醛固定）和生物化学（冷冻保存于-80 °C）研究。4.2.3. 肝功能评估采血后，通过室温下3000 rpm离心30分钟分离血清，并保存于-20 °C以进行进一步的生物化学分析。使用市售的罗氏诊断试剂盒测量血清中的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）值。4.2.4. 肝抗氧化防御系统和丙二醛（MDA）水平将所有肝组织在9倍体积的冰浴磷酸盐缓冲液中匀浆。匀浆液在4 °C下以12,000 rpm离心15分钟，分离上清液并分装，保存于-80 °C直至使用。使用上清液测定过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽还原酶（GR）和超氧化物歧化酶（SOD）的抗氧化酶活性，以及MDA和谷胱甘肽（GSH）的水平。如我们之前所报道的[41]，使用分光光度微孔板读数仪测量抗氧化酶活性以及MDA和GSH的水平。首先，通过测量560 nm处安普乐红吸光度的降低来确定过氧化氢酶活性。SOD活性通过动力学方法测量硝基蓝四唑的产生，其吸光度为560 nm。使用Cayman试剂盒测量GPx和GR的活性。SOD和过氧化氢酶活性以U/mg蛋白表示。GPx活性以U/mg蛋白表示。GR活性以mIU/mg蛋白表示。将GSH标准溶液或上清液（20 μg/50 μL）移取至96孔板的每个孔中。向每个孔中加入反应溶液，包括660 μM 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）、900 μM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和4.5 U/mL GR，然后在微孔板读数仪上于405 nm处记录5分钟。GSH水平以mmol/mg蛋白表示。使用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法测量MDA水平。将MDA标准溶液或上清液移取至1.5 mL试管中，并进行硫代巴比妥酸（TBA）测试。接下来，在532 nm处测定上述反应溶液的吸光度。TBARS测定结果以MDA当量（mmol MDA/mg蛋白）表示。4.2.5. 肝细胞因子水平将肝组织与蛋白酶抑制剂溶液（0.4 M NaCl、0.05% Tween 20、0.5%牛血清白蛋白、0.1 mM 苯甲基磺酰氟、0.1 mM 苯扎氯铵、10 mM 乙二胺四乙酸、10 μg/mL 抑肽酶）一起匀浆。匀浆液在4 °C下以12,000 rpm离心，分装并保存于-80 °C直至分析。使用ELISA试剂盒（R&D Systems，英国阿宾顿）根据制造商的协议评估白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白水平。IL-1β和TNF-α的水平以pg/mg蛋白表示。4.2.6. 组织病理学染色按照标准方案，将肝脏左叶的一部分保存在10%中性福尔马林溶液中，进行处理并石蜡包埋。切成4 μm厚的切片，进行脱蜡、脱水，并用苏木精和伊红（H&E）染色，以评估肝细胞坏死和空泡化。观察包括细胞大块坏死、气球样变性和炎性浸润在内的形态学变化。4.2.7. Western Blot分析对肝组织进行Western Blot分析，以测定Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和谷胱甘肽S-转移酶（GST）的蛋白水平。简而言之，将肝组织切成小块，并在9倍体积的冷裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.0、10 mM KCl、0.5% NP-40）中使用组织研磨器进行匀浆。将匀浆液孵育10分钟，然后以12,000 rpm离心20分钟，以获得胞质上清液。将胞质上清液分装并保存于-80 °C直至使用。使用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Ltd. Inc.，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）测定蛋白浓度，然后通过SDS-PAGE进行电泳分离。将蛋白样品转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上后，用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水在室温下封闭1小时。然后，将膜在4 °C下与针对Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GST的一抗（Santa Cruz Biotechnology，美国德克萨斯州达拉斯）孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔或羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）孵育。使用LAS-4000 mini成像系统（富士胶片，日本神奈川县）扫描图像，并使用MultiGauge v3.0软件（富士胶片）分析光密度数据。对于Western Blot分析，β-肌动蛋白（Proteintech，美国伊利诺伊州Rosemont）作为内参。4.3.1. 使用分光光度读数仪测定植物化学成分使用96孔BioTek PowerWave™ 340微孔板分光光度读数仪（BioTek Inc.，美国佛蒙特州Winooski）测定所有植物化学物质（包括总多酚（TPs）和聚苯乙烯苷（PPGs））的含量。TPs含量的测定方法基于与Folin-Ciocalteu试剂发生氧化还原反应形成蓝色产物，并在725 nm处测量其吸光度。四种蓟属植物甲醇提取物的TPs含量以每克提取物中儿茶素当量的毫克数表示[28]。PPGs含量的测定方法基于PPGs与Arnow试剂（含5%（w/v）硝酸钠和5%钼酸钠）形成有色产物，并在525 nm处测量其吸光度。四种提取物的PPGs含量以每克提取物中毛蕊花苷当量的毫克数表示[28]。![]()
表2. 四种蓟属植物甲醇提取物的HPLC梯度程序条件。4.3.3. Trolox当量抗氧化能力（TEAC）测定TEAC通过ABTS自由基清除测定法测定。简而言之，ABTS自由基由8 mM ABTS溶液和8.4 mM过硫酸钾溶液按2:1的比例制备而成。在室温下避光储存12~16小时后，用乙醇进一步稀释自由基溶液，使其在734 nm处的初始吸光度值达到（0.70 ± 0.05）。将175微升稀释后的ABTS溶液与25微升四种蓟属植物的甲醇提取物溶液或Trolox标准品混合。根据以下公式计算自由基清除能力的抑制百分比（I%）：I% = ((AABTS−Ablank)−(As-ABTS−As-blank))/(AABTS−Ablank) × 100，其中AABTS为ABTS溶液的吸光度，Ablank为以乙醇代替ABTS的吸光度，As-ABTS为存在样品时ABTS溶液的吸光度，As-blank为存在样品时乙醇的吸光度。TEAC值以Trolox当量（mmol Trolox/g样品）表示[28]。对血清生化水平、肝抗氧化酶活性、肝谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平、肝细胞因子水平以及Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GST表达水平的数据，采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett’s检验。所有统计评估的显著差异均使用SPSS软件（版本22，IBM，美国纽约州阿蒙克）计算，p值<0.05认为具有显著性。根据本研究结果，我们建议台湾地区的四种蓟属植物具有抗氧化和保肝作用。其中，C. arisanense Kitam.在四种蓟属植物中抗氧化活性最高，且其抗氧化活性与其多酚类化合物（PPG）含量密切相关。C. japonicum DC. var. australe Kitam.在四种蓟属植物中对四氯化碳（CCl4）诱导的急性肝损伤具有最强的保肝作用，这些保肝作用与其含有的水飞蓟宾差向异构体（α和β）和二氢芹菜素含量有关。C. japonicum DC. var. australe Kitam.对CCl4诱导的急性肝损伤的保肝机制可能涉及恢复肝抗氧化防御系统的活性和蛋白质表达，并抑制肝脏炎症以减少肝细胞坏死。未来，应进一步研究其对CCl4诱导的急性肝损伤的保肝作用的抗氧化和抗炎细胞信号通路，以及C. japonicum DC. var. australe Kitam.对慢性肝纤维化的保肝作用。
