086 研究快报 | 挥发性代谢组学和宏基因组学揭示了乳酸菌对苜蓿青贮质量、微生物群落和挥发性有机化合物的影响

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上种植最常见的饲料植物之一，广泛用于畜牧业。

青贮是一种饲料保存方法，通过将植物收获、切碎并储存在密封的外壳中进行发酵和保存，青贮饲料的气味来自挥发性有机化合物，酸涩的香气可以刺激牲畜的食欲，促进积极食用。

研究发现，乳酸菌在生长和新陈代谢过程中会产生大量的酸、醇、酯等可挥发性有机化合物（VOCs），而这些物质是风味的主要形成因素。

宏基因组学可以揭示不同发酵阶段微生物种类和相对丰度的变化以及生物群落中功能基因的表达，挥发性代谢组学可用于识别和定量分析青贮饲料中产生的各种VOC，从而能够评估青贮饲料的质量和气味特征，并可以通过与宏基因组学的结合分析来揭示微生物群落与VOC产生之间的关系。

目前，青贮和乳酸菌的研究主要集中在提高青贮饲料的营养品质上。但对于青贮饲料的重要评价指标的质量和气味特征研究较少。

本研究旨在通过外源添加市售和筛选的乳酸菌来揭示乳酸菌对紫花苜蓿青贮饲料品质、微生物群落和VOCs的影响，并确定改善青贮饲料气味的物质、功能和代谢途径，从而进一步提高饲料品质和利用率。

图示：紫花苜蓿

青贮制备

紫花苜蓿原材料在第一个开花期刈割，干燥并切短，接种菌种后进行青贮。

试验分为四组，各组分配方式如下：

CL：紫花苜蓿+市售的植物乳杆菌（10⁶CFU/g鲜样）。

LP：紫花苜蓿+筛出的植物乳杆菌（10⁶CFU/g鲜样）。

PP：紫花苜蓿+筛出的戊糖片球菌（10⁶CFU/g鲜样）。

CK：紫花苜蓿+蒸馏水（等量）。

LP和PP为从紫花苜蓿中筛选的菌株，由农业部牧草培育、加工与高效利用重点实验室提供。各处理设置六个重复，在室温（20-30 °C）下青贮30天后取样，以确定青贮饲料质量、微生物群落和VOC。

感官评估和质量分析

青贮饲料打开后立即采集100 g新鲜样品，以德国农业协会（DLG）建立的感官评估方法进行评估。六名专家根据青贮饲料的气味、质地和外观进行了评估。

DLG分数计算为所有单个分数的总和。DLG分数根据总体评分区分了五个质量等级：非常好（18-20）、好（14-17）、一般（10-13）、差（5-9）和腐败（0-4）。

另取10 g新鲜样品进行溶解提取，用于测定pH、乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸盐（PA）、丁酸（BA）和铵态氮（NH₃-N）。

另取足量青贮新鲜样品，在65℃烘干72 h并粉碎，用于后续测定CP、NDF及ADF、EE和WSC（水溶性碳水化合物）。

提取青贮苜蓿中的微生物进行测序，用于微生物宏基因组分析。新鲜样品用液氮冷冻后制粉，加入饱和NaCl溶液进行固相微萃取，用于挥发性有机化合物分析。

对感官评价和质量等级的影响

紫花苜蓿青贮饲料感官评价评分和质量等级的结果如表所示。

各组DLG分数为PP > LP > CL > CK。LP和PP组获得最高质量等级，非常好（19，18），其次是CL组（16），很好，而CK组获得最低等级，一般（13）。气味评分从高到低依次为PP、LP、CL和CK。

在结构和颜色评分方面，LP和PP组得分高于CK组。

CK组颜色较其他组略绿，茎叶结构变化不明显，但出现一些褐色枯萎组织。

与LP和PP组相比，CL组的颜色略深，但也有一些棕色枯萎的组织。

LP组和PP组青贮保存良好，两组颜色和结构差异不明显。

青贮饲料营养和发酵品质的差异

青贮饲料的营养成分如上图所示，接种乳酸菌对所有指标均有显著影响（P < 0.05）。

处理组的DM、CP、WSC和EE显著高于对照组，而NDF和ADF则显著低于对照组（P < 0.05）。

在处理组中，LP组的DM、CP和WSC显著高于CL和PP组，EE显著高于CL组，而NDF和ADF显著低于CL和PP组（P < 0.05）。

PP组的CP、WSC和EE显著高于CL组（P < 0.05），但PP组和CL组DM、NDF或ADF无显著差异（P > 0.05）。

发酵质量如上图所示，接种乳酸菌各指标均有显著影响（P < 0.05）。

处理组的LA和AA显著高于对照组，pH和NH₃-N显著低于对照组（P < 0.05）。

在处理组中，LP组的LA和AA显著高于CL和PP组，而pH和NH₃ -N显著低于CL和PP组（P < 0.05）。

PP组的LA和AA显著高于CL组，NH₃-N显著低于CL组（P < 0.05），而pH与CL组无显著差异（P > 0.05）。

青贮饲料微生物组成的差异

如上表所示，CK组和CL组的OTUs显著高于LP组和PP组（P< 0.05）。

CK组的香农多样性显著高于其他三组（P< 0.05）。

CL处理的辛普森指数显著低于其他三组（P< 0.05）。

LP组和PP组的Chao1和ACE值显著低于其他三组，而CK组的则显著高于LP组和PP组（P< 0.05）。

紫花苜蓿青贮饲料中细菌在属水平上的组成如图所示。

CK组的优势属为肠球菌属（93.21%），其次是加西氏菌属（69.18%）和乳植杆菌属 （36.33%）。CL组的优势属为乳植杆菌属 （90.33%），其次是片球菌属 （01.6%）和变形杆菌属（86.96%）。LP组的优势属为 Lactiplantibacillus （04.51%）。PP组的优势属为乳植杆菌属（91.38%），其次是片球菌属（46.1%）。

CK组的优势种为孟氏肠球菌 （24.41%），其次是 Garciella nitratireducens （14.97%）和植物乳植杆菌 （28.27%）。CL组的优势种为植物乳植杆菌 （21.91%），其次是戊糖片球菌 （92.27%）。LP组的优势种为植物乳植杆菌 （40.55%）。PP组的优势种为植物乳植杆菌 （35.73%），其次是戊糖片球菌 （2.4%）。其中，LP组植物乳植杆菌丰度最高，PP组戊糖片球菌丰度最高。

CK组中显著的细菌为 g_Enterococcus 、 f_Enterococcaceae 和 c_Clostridia。CL组中显著的细菌为 f_Mycobacteriaceae 、 s_Mycobacterium_sp_SCH5639931 和 g_Mycobacterium，LP 组中显著的细菌为 c_Bacilli 、 g_Lantiplantibacillus和 s_unclassified_Lantiplantibacillus。

青贮饲料VOCs组成的差异

各组VOCs主要由萜烯类（25.17%）、酯类（51.18%）、杂环类化合物（85.7%）、醇类（22.6%）、醛类（68.6%）和酮类（68.<>%）组成。

其中，CK组萜烯类和醇类含量最高，其次是CL、LP和PP组。PP组的酯含量最高，其次是LP、CL和CK组。CL组杂环化合物和醛类的含量最高，其次是CK、LP和PP组。

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果显示，各组之间有明显的分离，表明来自不同苜蓿青贮饲料的VOCs彼此独立。CK组与处理组差异显著，PP组与CK组差异最大，CL组与CK组差异最小。

据小提琴图显示，萜类化合物（50）、酯类（2）、烃类（19）、杂环化合物（13）和醇类（5）是主要物质。LP和PP组香叶酰乙酸酯、左薄荷醇和β-罗勒烯等萜烯含量高于其他组，但CL组β-紫罗兰酮含量较高。

LP组和PP组苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和水杨酸乙酯等酯类含量高于其他组，而CK组对甲苯酯含量较高。处理组3-辛醇含量高于CK组，LP和PP组3-乙酰-3-乙基吡嗪含量高于其他组。

差异VOCs与微生物的相关性分析

植物乳植杆菌和布氏乳酸甜乳杆菌与苯甲酸甲酯、乙酸苯乙酯、水杨酸甲酯、苯甲酸乙酯和水杨酸乙酯呈正相关，而与苯甲硫醇、N-亚甲基乙烯胺、2-羟基乙基六烯酸乙酯、苯甲醛和3-甲基异龙脑呈负相关。

戊糖片球菌和乳酸片球菌与3-辛醇、苯并噻唑、2-甲基庚基乙酸酯、5-甲基-3-丙基壬烷和左薄荷醇呈正相关。相比之下，卡塞利黄肠球菌与苯甲硫醇、对甲苯乙酸酯、2-羟基乙酸乙酯、β-紫罗兰酮和<>-甲基异龙脑呈正相关，而粪肠球菌和蒙蒂肠球菌具有相似的相关性。

基于CAZy和eggNOG数据库的微生物基因功能组成

结果表明，各组基因功能主要在糖基转移酶（GT）、糖苷水解酶（GH）和碳水化合物结合模块（CBM）中注释。在处理中，CL组GT2丰度较高，而CK组GT4和GT1丰度较高。

LP组GH23和GH140丰度较高，PP组GH32、GH42和GH50丰度较高，CBM50的丰度在PP和LP组中较高。

基于eggNOG数据库的苜蓿青贮饲料的微生物功能组成表明，各组基因功能主要以L（复制、重组和修复）、S（功能未知）、K（转录）、E（氨基酸转运和代谢）和G（碳水化合物转运和代谢）进行注释。

在处理中，CK组C（能量产生和转化）和J（翻译、核糖体结构和生物发生）丰度较高，O（翻译后修饰）、K、E、M（细胞壁/膜/包膜生物发生）和P（无机离子转运和代谢）丰度较高，PP组L丰度较高。L和K与微生物生长和繁殖有关，它们在处理组中的较高丰度表明乳酸菌的添加可以促进青贮过程中的微生物代谢活动。

基于KEGG数据库的微生物基因功能组成

各组的优势功能为碳水化合物代谢、氨基酸代谢以及辅助因子和维生素的代谢。

各处理组中，PP组的功能丰度高于其他组，而LP和CL组高于CK组。

CK和LP组的优势功能是磷酸转移酶系统、淀粉和蔗糖代谢以及肽聚糖生物合成。CL组的优势功能为谷胱甘肽代谢、淀粉和蔗糖代谢以及肽聚糖生物合成。PP组的优势功能是氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢以及肽聚糖生物合成。

采用LEfSe法评价各组微生物功能的差异，CK组影响显著的功能是L2_membrane转运、L3_drug耐药抗菌和L3_phosphotransferase系统。CL组影响显著的功能是L2_chlorocyclohexane和氯苯降解。LP组具有显著影响的功能是其他次生代谢物和L3_penicillin和头孢菌素生物合成L3_biosynthesis。PP组影响显著的功能是L<>_amino糖和核苷酸糖代谢。

基于KEGG数据库的VOCs功能注释和富集分析

排名前39位的代谢途径主要分为两大类：有机体系统和代谢。其中，不同环境中的微生物代谢（28）、次生代谢物的生物合成（23）和芳香族化合物的降解（13）代谢物在不同环境中更多。

差异VOCs的代谢途径分为三大类：有机体系统、代谢和人类疾病。其中，不同环境中的微生物代谢（11）、次生代谢物的生物合成（9）和芳香族化合物的降解（6）代谢物较多。

结果与展望

这项基于挥发性代谢组学和宏基因组学的研究显示，紫花苜蓿青贮饲料中的主要VOCs是萜类化合物、酯类和杂环化合物。在这些化合物中，苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和水杨酸乙酯等酯是香气的主要来源。

LP和PP组具有较高的感官等级和质量等级，优势菌为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），在碳水化合物和氨基酸代谢、次生代谢产物生物合成和芳香族化合物降解代谢途径中的功能显著丰富。VOCs的组成可以通过调节微生物群落和代谢途径来改变，这为改善青贮饲料的气味和质量提供了新思路。

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