研究背景
在饲料全面禁抗的背景下，饲粮添加中草药制剂成为畜牧业发展的一个有效替代方案。
相对于抗生素，中草药通常被认为具有较低的毒性，耐药性风险更低，并且其具有材料来源天然、用途广泛、安全可靠、经济且环保的优势。
近年来随着生物技术的发展，特别是微生物组和代谢组学的兴起，越来越多的研究表明，肠道微生物和肠道代谢产物可以与动物身体的器官和组织相连，这些器官和组织所组成的反应链被称为“轴”，如：肠-睾丸轴、肠-肝轴和肠-心轴。
其中，肠-肝轴通过肠道微生态与宿主之间的相互作用来控制动物的营养代谢，在确保动物健康生长方面起着至关重要的作用。然而，对反刍动物肠-肝轴的研究仍然较为有限。
因此，本研究主要采用代谢组学和16s来检验中草药制剂对湖羊肠和肝轴的影响，同时揭示中草药制剂在调节湖羊营养代谢、肠肝循环和免疫功能中的作用。
图示：全株玉米
材料与方法
试验选用平均初始体重为（19.57±1.56 kg）的18只健康雄性湖羊作为试验动物。18只雄性湖羊，随机分为3组，每组6只，各组的试验分配如下：
对照组（Con）：饲喂基础日粮。
试验1组（T1组）：饲喂0.5%中草药制剂浓缩物。
试验2组（T2组）：饲喂1%中草药制剂浓缩物。
中草药制剂的营养成分和基础日粮的组成与营养水平如下：
试验正式实验期为90 d，另加预试期为7d。在预试的7天里将草药制剂与饲料混合，将含有0.5%和1%草药制剂的浓缩补充剂分别成比例逐渐增加。
第1-2天添加1/4的浓缩补充剂，第3-4天添加总剂量的1/3，第5-6天添加总剂量的2/3，第7天添加全部剂量。
每天早上7：30开始喂食，
在试验最后一天，对试验羊空腹处理后进行屠宰，屠宰后迅速采集肝组织标本及回肠内容物标本，用于总RNA和蛋白质提取。
其中回肠样本用于检测回肠免疫指标，包括回肠包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、C3和C4含量。
使用广靶点UPLC-MS/MS代谢组学方法和回肠微生物的16S测序，对回肠和肝轴代谢物进行了广泛的代谢分析，以用于研究湖羊肠肝轴的代谢变化。
试验结果
肝组织切片结果
对肝组织切片观察，如图所示。
对照组湖羊的肝脏形态较规则，肝带排列整齐，在肝组织的门静脉区域可以看到少量的胶原纤维，而T1和T2组湖羊肝组织门静脉区胶原纤维增生，可见纤维间段的形成，但差异不显著。
与对照组相比，T1、T2淋巴细胞增加但差异不明显，结缔组织有一定增生但差异不明显，提示中药制剂对湖羊肝脏无明显病变和异常，提示中药饲料添加剂可用于湖羊的健康繁殖，对湖羊肝组织的副作用较小。
对回肠免疫指标的影响
从表中可以看出，试验I组血清IgA、IgG和C3含量显著高于对照组（P <0.05）；两组血清C4和IgM含量差异无统计学意义（P >0.05）。
代谢物定性和定量分析
对回肠进行了代谢组测序，并进行了特异性鉴定和分析，共检测到1202种代谢物。
这些代谢产物进一步分为不同类别，包括：氨基酸及其代谢物378种，苯及其衍生物102种，醇类和胺类51种，胆汁酸21种，辅酶和维生素类21种，甘油磷脂94种，核苷酸及其代谢物87种，激素和激素相关物质31种，醛类和酯类22种，碳水化合物及其代谢物51种，有机酸及其衍生物164种; 71种杂环化合物和89种脂肪酰基。
湖羊回肠的主要成分是氨基酸及其代谢产物和有机酸及其衍生物。
不同比例的中草药制剂对回肠代谢物的影响差异
聚类图和热图显示了代谢物变体的清晰聚类，变异性趋势如图。
根据不同组的Vennen图，在三组中共同时鉴定出8种不同的代谢物。
有机酸及其衍生物、苯及其衍生物、核苷酸及其代谢物、胆汁酸、氨基酸及其代谢物、激素和激素相关物质被鉴定为重复的差异代谢物。
在Con与T1中共鉴定出120种具有显著差异的代谢物，包括31种上调和89种下调代谢物。
在Con与T2中共鉴定出263种具有显著差异的代谢物。包括134种上调和129种下调代谢物。
在Con vs T2和T1 vs T2之间的差异代谢物中，表现出许大量代谢物上调。
这一结果表明，加入中草药制剂后，大量代谢物在回肠中积累。他们中的大多数都被上调了。T1与T2共鉴定出135种具有显著差异的代谢物，包括91种上调和44种下调代谢物。
回肠中代谢物的差异与代谢特征
根据生成KEGG分类和气泡图的差异代谢物，确定潜在的发育相关生物标志物（与肠肝轴营养代谢以及抗氧化剂和免疫力相关）并筛选和注释差异代谢物。
Con和T1在类固醇激素合成以及色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、胆汁分泌、维生素消化和吸收、氨基酸和核苷苷代谢以及谷胱甘肽和花生四烯酸代谢的途径方面存在差异。
Con和T2在代谢物的代谢途径上有所不同，主要是苯丙氨酸和色氨酸的代谢、类固醇的生物合成、胆汁酸的分泌、花生四烯酸的代谢、初级胆汁酸的分泌、维生素的消化和吸收。
T1和T2在代谢物的代谢途径中为主，具体有类固醇代谢、胆汁酸和原代胆汁酸分泌、胆固醇代谢、维生素消化和吸收以及花生四烯酸代谢。
对肝脏代谢物的差异
分析了Con与T1、T1与T2和Con与T2之间的差异代谢物，发现：
在Con与T1中共鉴定出176种存在显著差异的代谢物，包括30种上调代谢物和146种下调代谢物。
T1与T2中共鉴定出55种存在显著差异的代谢物，这包括35种上调和20种下调的代谢物。
Con与T2共鉴定出168种具有显著差异的代谢物。包括55种上调和113种下调代谢物。在T1与T2之间的差异代谢物中，显示出许多上调的代谢物。
大部分氨基酸及其代谢产物、苯及其衍生物、胆汁酸、有机酸及其衍生物、碳水化合物及其相关物质呈下降趋势。
肝脏代谢产物的代谢途径
差异代谢物的Con和T1的主要代谢途径为：花生四烯酸代谢、维生素消化吸收、谷胱甘肽代谢、初级胆汁酸生物合成和胆汁分泌。
代谢物Con和T2的主要代谢途径为：花生四烯酸代谢、糖酵解、胆汁分泌、维生素消化吸收、胆固醇代谢、谷胱甘肽代谢、蛋白质消化吸收、维生素B6代谢、初级胆汁酸生物合成。
T1和T2的主要途径包括糖酵解、胆汁分泌、谷胱甘肽代谢、逆行内源性大麻素信号传导、蛋白质消化和摄取以及维生素消化和摄取。
同时，与差异代谢物相关的主要代谢途径主要涉及能量代谢、胆汁酸代谢与肠肝轴免疫、循环和抗氧化作用。
分析了三组差异代谢物的通路，发现脂肪酰基代谢物（（±）5-HETE）、5,6-DiHETrE位于图的中心，并与氨基酸及其衍生物（N-甲基丙氨酸）Gly-Ile、醛和酮代谢物（N-乙基甘氨酸）和有机酸及其代谢物（2-甲基柠檬酸）等其他代谢物密切相关。
这些代谢物共同促进肝脏抗氧化、抗炎、营养吸收和物质代谢。
回肠微生物
通过16srRNA基因测序分析了回肠菌群的组成。在门水平上，Firmicutes, Actinobacteriota, Bacteroidota, Proteobacteria, Verrucomicrobiota与Con相比呈上升趋势。在属水平上，与Con相比，Christensen’s algae R_7_group, Eubacterium hallii_group, Lachnospiraceae_NK3A20_group, Arthrobacter, and NK4A214_group呈增加趋势。
相关性分析
回肠中的3-epideoxycholic acid与肝脏中的异脱氧胆酸呈显著负相关（P <0.05）。
回肠β-deursolic acid与肝脏3-epi-deoxycholic acid呈显著正相关（P <0.05）。
γ-硫醇酸与回肠中的厚壁门呈正相关。
此外，γ-硫醇酸和胆酸、β-穆里胆酸被确定为拟杆菌属的相关胆汁酸，猪去氧胆酸、异石胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸与放线杆菌属呈正相关。
肝脏中与Firmicute相关的胆汁酸是γ-硫醇酸、异酚脱氧胆酸，并显示出正相关。与Bacteroidota相关的胆汁酸是γ-硫醇酸、胆酸和异脱氧胆酸。与Actinobacteriota
相关的胆汁酸为γ-硫醇酸、胆酸和异软脱氧胆酸呈正相关。
本研究中，作者发现中草药制剂的添加导致湖羊肝脏和回肠中氨基酸及其代谢物、有机酸及其代谢物、胆汁酸的含量增加，以及肠肝菌群（厚壁菌门和拟杆菌门）的丰度增加。
这表明添加中草药制剂可以促进湖羊回肠和肝脏营养物质的消化、吸收和代谢，以及提高对机体的抗氧化和免疫作用，促进肠肝循环，调节肠肝菌群的丰富性，增加对腹泻的抵抗力。
添加中草药制剂的添加量为0.5%时，效果最佳。
了解更多请阅读原文献：
https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1454334
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