研究背景
农场动物以反刍动物、粪便和土地利用等形式加剧了温室气体排放，目前畜牧业的甲烷排放已经成为全球第二大的温室气体排放因素。
许久以来牲畜的粪便被认为是甲烷的重要滋生地，近来一项研究表明，瘤胃微生物群会对奶牛的甲烷排放造成显著影响，同时也有研究提出，微生物和代谢途径的特异性富集能够改善能量和碳通道，同时降低牲畜甲烷排放。
人们普遍认为，甲烷的产生主要来自古菌的功能和代谢，然而除了古菌，对低甲烷产量绵羊瘤胃的宏基因组和宏转录组分析的研究也揭示了细菌通过控制乳酸形成与利用来影响甲烷的排放。此外，厌氧真菌也能在多糖降解过程中与细菌和古菌竞争，对甲烷释放发挥重要作用。
如此多种的菌都对甲烷产生有着重要影响，关键问题在于家畜废物中大量甲烷排放的驱动因素是什么，它们是否与微生物共生过程有关，包括微生物群落组成、多样性、活性和宿主的发育阶段的变化。
本研究探讨了产甲烷古菌与细菌在家畜废物中的关联，并提出了微生物群落策略可能限制甲烷排放，及其对温室效应的贡献。
图示：研究摘要
材料与方法
选用条件相近、来自四个发育阶段（1岁、1.5岁、2.5岁和4岁）的奶牛，奶牛均在环境控制和高卫生标准的环境中饲养，并饲喂相似的标准玉米-大豆饲粮。
饲粮随着年龄段的不同有着些许变化：对于1岁年龄组的乳牛，其饮食中包含较低比例的青贮玉米（约70%），而1.5岁和2.5或4岁组的比例分别为80%和90%。
每个组别收集3份以上的新鲜直肠粪便样本，稀释后在厌氧环境中进行避光保存，后续测定甲烷和二氧化碳浓度，pH和乙酸浓度、吉布斯自由能以及碳稳定同位素分析。
收集样本进行宏基因组测序，同时为验证数据的普适性，另从一牧场选取情况相同的奶牛进行取样做微生物分析。
对宏基因组数据进行注释、构建系统发育树、微生物组成、双分子共现网络分析、相关性分析等统计分析。
试验结果
甲烷产生潜力和途径
在奶牛发育阶段（大约1岁），其甲烷潜力最大，显著大于其他组。
中间阶段（2.5岁）与发育阶段相比显著下降，而最老的牛（4岁）显示出最低的甲烷潜力。
乙酸浓度在1岁年龄组中先增加后减小，与甲烷的生产-消化的关系呈正相关。
稳定同位素分析表明，早期阶段的δ13C-CH4和α值分别为-40‰和1.025，判定这是以乙酰基甲烷生成途径为主。
最老的组（4岁）种，CO2还原生成甲烷的途径为主，δ13C-CH4和α值分别为-60‰和1.05，而中间发育阶段的粪便以两条途径产生甲烷，1.5岁年龄组为-50‰和1.04，2.5岁年龄组为-45‰和1.03。
1岁年龄组粪便的乙酰基甲烷生成的吉布斯自由能在实验的最后几天略有增加，但保持在较低值，其他各组在试验期间无显著变化。
MAGs的数据分析
试验获得了超过120 Gbp的高质量宏基因组测序数据。获得的高质量读段也进行了共组装，产生了304,847个contigs，N50长度为8,288 bp。
通过共组装后的基因组分箱，共恢复了288个独特的细菌（279个MAGs）和古菌（9个MAGs）基因组，包括67个高质量MAGs（完整性>95%且污染<5%）和221个中等质量MAGs（完整性>50%且污染<10%）。整体平均完整性和污染率分别为82.38%和3.71%。
MAGs涵盖了13个门，包括来自厚壁菌门（104个MAGs）、拟杆菌门（81个MAGs）和变形菌门（58个MAGs）的细菌，以及来自古菌界尤里古菌门（9个MAGs）的古菌。
分析了微生物组的多样性，包括Chao1、Shannon和Inverse Simpson指数在内的alpha多样性指数，各组均没有显著差异。而微生物群落结构与微生物环境显著相关，这一点反映在发育梯度的丰度映射上。
在门水平上，变形菌门始终占据主导地位（>50%），其次是拟杆菌门（约20%）和厚壁菌门（约8%）。
多糖降解
通过检查获得的MAGs的代谢重建，对负责聚合物有机物质降解和甲烷产生的潜在微生物、途径和相互作用进行了评估，如上图所示。
不同发育阶段的牛粪中微生物群落组成差异显著。
编码纤维素酶和木聚糖酶的微生物主要属于拟杆菌门，拟杆菌门在所有四个阶段的粪便中都是最丰富的门（分别为1岁、1.5岁、2.5岁和4岁年龄组中恢复的群落的31.0%、25.9%、36.2%和30.4%）。
拟杆菌门在所有四个阶段的粪便中都是最丰富的门，在1岁、1.5岁、2.5岁和4岁年龄组中群落的占比分别为31.0%、25.9%、36.2%和30.4%。
编码纤维素酶的拟杆菌门具有高相对丰度，编码木聚糖酶的拟杆菌门也如此，这表明多糖降解途径主要由这些门的微生物所影响。
厚壁菌门、纤维杆菌门和螺旋体门在所有样本中也都能被检测到，但丰度较低。拟杆菌门是主导门，占据了每个发育阶段的微生物群落主要组成成分。
但在乳牛粪便中，多糖降解似乎不是控制甲烷产生的关键因素。
在单糖降解方面，降解葡萄糖的微生物与降解半乳糖的微生物显示出非常高的相似性。
拟杆菌门在单糖降解中的作用十分关键，而随着发育阶段的推移，变形菌门逐渐参与进去，属于尤里古菌门的MAGs也影响了葡萄糖和半乳糖利用途径。
产氢甲烷菌从1岁到4岁年龄组的丰度增加，与甲烷累积增加量不一致。
在所有样本中都发现了热塑菌门，这表明它们可能在甲烷产生中发挥作用。
来自厚壁菌门、纤维杆菌门、疣微菌门和螺旋体门的甲烷氧化菌在1岁年龄组粪便中丰度较高，这也表明甲烷氧化菌可能氧化了一定比例的甲烷。
细菌-产甲烷古菌双分子共现网络
试验鉴定出了57108个具有碳水化合物活性酶（CAZy）活性的基因，这些基因属于259个CAZy家族。
细菌-产甲烷古菌关联的双分子共现网络分析显示细菌节点占据了主要比例，表明细菌在微生物组中对甲烷产生有着重要作用，其中厚壁菌门和拟杆菌门在发挥主要作用。
随着宿主年龄增加，共现网络的边和节点的数量都逐渐减少。
早期阶段的乳牛粪便的细菌-古菌关联选择性在四个阶段中最强。随着年龄的增长，古菌节点的百分比逐渐降低，表明奶牛后期阶段产甲烷古菌的共现性减弱。
属于Methanosarcinaceae科的MAG.271，虽然丰度低于属于Methanocorpusculaceae科的MAGs，但与细菌MAGs的连接更多，进一步证实了这种低丰度产甲烷古菌的关键贡献。
4岁年龄组粪便的网络只包含了一个产氢产甲烷古菌MAG.189，这与同位素分析结果一致，表明这一组主要通过CO2还原产生甲烷。
甲烷产生受功能活性影响
在宏基因组数据中鉴定出超过2亿个基因，这些基因属于5846个KEGG基因同源物。
KEGG基因同源物的alpha多样性在四个组之间均未发现显著差异，几乎所有参与甲烷生成的基因都与甲烷产生呈正相关，这种相关关系在统计学上不显著，这表明甲烷生成过程可能受到其他因素的影响。
根据KEGG基因同源物丰度计算的Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，不同发育阶段的粪便中微生物组的代谢存在差异。
在KEGG同源物的组成参数与甲烷产生参数之间没有观察到显著关联，这可能与微生物多样性、丰度和功能的变化有关。
CAZy家族的第一轴（PCoA1）与δ13C-CH4呈正相关，但与α值呈负相关，表明CAZy家族对甲烷生成途径的重要性。
早期阶段，细菌PCoA1与乙酸的产生和消耗呈正相关，细菌的CAZy合成显著影响了甲烷积累（P< 0.05），进一步证实了细菌限制了甲烷的产生。
结果与展望
本研究证明，年轻乳牛（1岁）粪便的甲烷产生量与老年乳牛（4岁）的产生量有着显著差异，最大相差为6倍。
宏基因组组装基因组分析揭示了甲烷产生的代谢通量，试验通过稳定的同位素和网络分析验证了典型的乙酰基甲烷生成途径实现了强大的甲烷产生潜力。
作者的研究将碳和甲烷代谢范式与特定微生物谱系联系起来，这些谱系由乳牛的发育阶段所塑造。
微生物群落组成、代谢途径和微生物相互作用之间的相互作用在年轻乳牛粪便中观察到的较高甲烷产生起着关键作用。乙酰基甲烷菌的主导地位、尤里古菌门类群的较高比例、细菌与产甲烷古菌之间的密切相互作用，以及碳水化合物活性酶的存在，都有助于增强年轻乳牛粪便中的甲烷产生。
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