085 研究快报 | 在过渡期补充柑橘皮提取物可改善奶牛瘤胃微生物组成、能量代谢和泌乳性能

文摘   2024-12-08 12:01   北京  

研究背景

苜蓿是一种常用的蛋白含量高、适口性佳的粗饲料。新鲜苜蓿主要以苜蓿干草或苜蓿青贮的形式长期保存。已有研究表明,牧草的储存方式会显著影响喂食的奶牛所产的牛奶成分。
能量负平衡(negative energy balance, NEB)是围产期奶牛常见的生理状态,该状态下的奶牛通过利用大量体脂来满足机体对能量的需求,导致了大量的非酯化脂肪酸(NEFA)释放,而过量的NEFA进入肝脏后会引发甘油三酯(TG)的大量累积,最终导致肝损伤的情况发生。
能量负平衡的状态下,奶牛常患脂肪肝、酮病,严重影响奶牛机体健康。研究发现,瘤胃微生物群会直接影响挥发性脂肪酸(VFA)的水平,增加对VFA的吸收可以减轻肝损伤并减缓脂肪细胞分解脂肪。研究发现,患有高酮血症的奶牛瘤胃中的VFA含量以及一些微生物属(Prevotella, Ruminococcus, Selenomonas, Succinivibrio )会减少。因此,调节瘤胃微生物群可能有助于改善奶牛的代谢性疾病如脂肪肝、酮病。
目前,植物天然提取物以其低毒性、来源广等优势被广泛作为饲料添加剂使用。柑橘皮提取物(Citrus Peel Extract, CPE)是常见的天然提取物之一,其中富含黄酮类化合物,如橙皮苷。有研究表明,橙皮苷在多种动物模型以及细胞中表现出明显的抗炎作用。此外,还有研究表明,柑橘皮类黄酮提取物有改变奶牛后肠微生物群组成,降低高淀粉日粮奶牛血清炎症细胞因子等功能。
然而,CPE对奶牛过渡期瘤胃微生物群、能量代谢和泌乳性能的影响尚无充分研究。故此研究通过在日粮中添加CPE来调节瘤胃微生物群组成、缓解NEB并且提高奶牛泌乳性能,从而探究CPE对过渡期奶牛瘤胃微生物群、脂肪组织与肝脏中葡萄糖和脂质的代谢以及产奶量的影响。

图示:柑橘皮

材料与方法

选取30头胎次和体重均相近的奶牛,每天分别在7:00、13:00、19:00喂食三次,所有奶牛均可自由饮水并饲喂全混合日粮。试验进行6周(产前3周、产后3周),适应性喂养一周后,所有奶牛被随机分为两组:对照组(CON)和CPE处理组(每天早晨投料前通过灌胃给药的方式补充4克CPE)。
研究过程中收集了血清、牛奶、瘤胃液、脂肪组织和肝脏样品,以评估CPE对奶牛的影响。
在产后第21天收集奶样,并连续三天记录产奶量,奶样作防腐处理后放于4℃下保存,用于后续测定牛奶成分(乳脂、乳蛋白和乳糖)。
在产后第7、14和21天于晨饲前通过尾静脉采集血液样本,测定血清中非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟基丁酸(BHBA)、葡萄糖、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)等指标。
在产后第21天通过活检采集肝脏和脂肪组织样品,放入液氮中保存,用于后续进行TG测定、组织学特征分析、总RNA测定、蛋白质提取与印迹分析等。
在试验最后一天早上喂食3h后收集瘤胃液,测定pH值、总VFA、乙酸、丙酸、氨态氮(NH3-N)等指标。提取瘤胃液中的微生物DNA,进行16S rRNA测序以分析微生物群落组成。
采用Spearman相关系数计算瘤胃微生物组与瘤胃发酵参数、泌乳性能、代谢参数和肝脏TG之间的相关性。使用Majorbio Cloud平台对瘤胃液样本进行生物信息学分析。将包括Shannon、Simpson、Sobs、ACE和Chao在内的α多样性与Mothur(v1.30.1)进行比较。基于Braycurtis相异性,使用Vegan v2.5-3包,通过主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)确定β多样性,以比较CON组和CPE组之间的相似性和差异。使用Vegan v2.5-3包进行ANOVA检验,以评估统计学显著性。并进行线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)以确定显著丰富的分类群。
采用SPSS 19.0或GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计。所有数据均采用非配对t检验进行分析。P< 0.05被认为具有统计学意义,P< 0.01被认为具有极显著性差异。数据以均值±标准误(SEM)表示。

试验结果

血浆生化指标

补充CPE对泌乳性能和代谢参数的影响

与对照组相比,补充CPE的奶牛产奶量显著增加,乳蛋白和乳糖含量也显著增加。此外,CPE组的乳脂含量略高于对照组。

与对照组相比,CPE组血清NEFABHBA和胰岛素水平显著降低(P˂ 0.05),血糖水平显著升高(P˂ 0.05),血清肝功能指标ALTAST水平降低(P˂ 0.05),且CPEHp水平低于CON组(P˂ 0.05)。

补充CPE对瘤胃发酵参数的影响

各组瘤胃pHNH3-N浓度无显著差异。然而,添加CPE后瘤胃中总VFA含量显著增加P˂ 0.01,同时醋酸盐、丁酸盐(P˂ 0.05丙酸盐(P˂ 0.01的浓度显著升高。结果表明,补充CPE可以提高奶牛瘤胃中VFA的产量。

CPE对瘤胃微生物群的影响

α多样性分析显示CPE组的Shannon指数降低(P˂ 0.01),Simpson指数增加(P˂ 0.01)。PCAPCoA结果表明,瘤胃微生物的节点在坐标轴不同区域显著分离(ANOSIMP ˂ 0.01),这表明在OTU水平上,CON组和CPE组具有不同的瘤胃微生物组成。结果表明,CPE降低了瘤胃微生物群落的丰富度和多样性。

CON组与CPE组瘤胃微生物的差异

使用LEfSeLDA方法鉴定了两组中特征性的瘤胃细菌,总共鉴定出28个细菌分类群(LDA > 2.5)。进化树显示了细菌种群从门到属水平的显著差异,LDA条形图显示了在CONCPE组之间观察到的每个物种丰度的差异。Wilcoxon秩和检验进一步表明,在科水平上,CPE组中普雷沃氏菌科Prevotellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae、拟杆菌目_RF16_Bacteroidales_ RF16_group和硒单胞菌科Selenomonadaceae的丰度显著增加(P˂ 0.05),Oscillospiraceae,F082,Ruminococcaceae,Christensenellaceae, Muribaculaceae, UCG-011, Saccharimonadaceae, Hungateiclostridiaceae,Spirochaetaceae的丰度显著降低(P˂ 0.05在属水平上,补充CPE显著增加了Prevotella,Methanobrevibacter,norank_f__Bacteroidales_RF16_groupButyrivibrio的丰度(P˂ 0.05,而降低了norank_f__ F082, Lachnospiraceae_NK3A20_group, NK4A214_group, Christensenellaceae_R-7_group, norank_f__Muribaculaceae, Ruminococcus, Olsenella, Prevotellaceae_UCG-003,norank_f__UCG-011的丰度(P˂ 0.05

补充CPE对脂肪组织的影响

结果表明,CPE组奶牛脂肪组织中p-HSLHSL的比率(P˂ 0.01)和ATGL的蛋白丰度(P˂ 0.05)降低,而PLIN1CIDEC的蛋白丰度(P˂ 0.05)升高。

此外,CPE组与CON组相比,p-NF-κB的蛋白丰度降低(P ˂ 0.05),而IκBα的表达(P˂ 0.01)和p-AKTAKT的比率(P˂ 0.01)升高。CPE组中NLR家族含pyrin结构域蛋白3NLRP3)、细胞因子信号抑制因子3SOCS3)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(CASPASE-1)、肿瘤坏死因子-α(TNFA)、白介素18IL-18)和白介素1BIL-1B)的mRNA丰度较低(P < 0.05)。综上所述表明,CPE可以减轻奶牛脂肪组织的脂解和炎症反应,同时增强胰岛素敏感性。

补充CPE对肝脏的影响

结果表明,CPE组降低了奶牛肝脏中的脂质累积。与CON组相比,CPE组显著降低了SREBP-1c的蛋白丰度(P˂ 0.05),同时增加了PPARα的蛋白丰度和p-AKTAKT的比率(P˂ 0.01)。

此外,与CON组相比,CPE组中SREBP-1c、乙酰辅酶A羧化酶1ACC1)和脂肪酸合酶(FAS)的mRNA丰度降低,而PPARA、酰基辅酶A氧化酶(ACO)、肉碱棕榈酰转移酶1ACPT1A)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的mRNA丰度增加(P< 0.05)。

综上,CPE的添加降低了奶牛肝脏中脂质的积累,并提高了肝脏的胰岛素敏感性和糖异生作用。

瘤胃微生物组与瘤胃发酵参数、泌乳性能、代谢参数和肝脏TG含量的相关性分析

相关性分析表明,总VFA浓度和丙酸浓度与普雷沃氏菌属呈正相关(P< 0.01),norank_f__MuribaculaceaeP< 0.01)、瘤胃球菌属(P< 0.01、毛螺菌科_NK3A20_P< 0.05norank_f__F082NK4A214_组和克里斯滕森氏菌科_R-7_组(P< 0.01)呈负相关

此外,发现NH3-N浓度与norank_f__norank_o__RF39呈负相关(P< 0.05)。产奶量和乳糖含量与普雷沃氏菌属呈正相关(P<0.05),与norank_f__ F082, NK4A214_group,norank_f__Muribaculaceae瘤胃球菌属(P< 0.05)呈负相关。产奶量也与克里斯滕森氏菌科_R-7_组呈负相关(P< 0.01)。

此外,葡萄糖浓度与norank_f__F082NK4A214_group呈显著负相关P< 0.05),NEFA水平norank_f__F082norank_f__MuribaculaceaeRuminococcus呈正相关(P< 0.05,而BHBA水平与Ruminococcus呈正相关,但与Acetitomaculum呈负相关(P< 0.05)。胰岛素浓度与Rikenellaceae_RC9_gut_group呈负相关(P< 0.05)。ALT水平与unclassified_f__PrevotellaceaePrevotellaParaprevotella呈负相关(P< 0.05),但与norank_f__F082呈正相关(P< 0.01),与NK4A214_groupChristensenellaceae_R-7_groupRuminococcus呈正相关(P< 0.05

AST水平与Christensenellaceae_R-7_groupnorank_f__Muribaculaceae呈正相关(P< 0.05Hp浓度与Paraprevotella呈负相关(P< 0.05,与NK4A214_group呈正相关(P< 0.05)。此外,肝脏TG含量与未分类的Prevotellaceae属(P< 0.05)呈正相关,与Acetitomaculum属和norank_f__ norank_o__Clostridia_UCG-014呈负相关(P< 0.05)。

结果与展望
综上所述,日粮中补充CPE可提高奶牛泌乳性能,减轻NEB,缓解奶牛产后脂肪组织的脂质动员和炎症发生。这些CPE的有益作用可能归因于瘤胃微生物群组成的改变和瘤胃VFA含量增加。因此,在奶牛日粮中补充CPE可能是提高产奶量和改善泌乳早期能量代谢的潜在策略。

了解更多请阅读原文献:

https://doi.org/10.1186/s40104-024-01110-8

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文案 | 张  歆
编辑 | 原  昊

草食幼畜in反刍动物饲料创新团队
中国农业科学院饲料研究所反刍动物营养与饲料创新团队,专注(幼龄)草食动物营养与健康研究。以此公众号传播团队和行业动态,搭建与同行们交流平台,推广牛羊兔鹅马驴鹿等健康饲养和营养技术。
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