撰文：白露Eileen | 编辑：珊珊
调节性T细胞(Tregs)是CD4+T细胞的一个亚群，表达FOXP3转录因子，它在肺和其他器官的稳态和应激条件下，通过抑制过度兴奋的免疫系统激活，在促进免疫稳态方面具有多种功能。本公众号在前期文章介绍过调节性T细胞（Treg）免疫细胞疗法的一些应用。
往期推送：
本期公众文将分享2023年6月在《Clin Immunol》杂志发布的一篇题为“Manufacturing Regulatory T cells for Adoptive Cell Therapy in Immune Diseases: A Critical Appraisal”的综述，该综述分析总结了目前过继Treg疗法（adoptive regulatory T cell therapies, TRACT）的生产方法，以及评估其临床研究结果。
Treg过继细胞疗法（TRACT）生产方法学
制备过继Treg疗法主要包括三个关键步骤：细胞分离、体外扩增和质量检测（图1）。通常情况下，Treg从外周血中分离出来，并通过添加CD3/CD28以及白介素-2（IL-2）在体外进行培养扩增，以制备出足以达到治疗剂量的Treg数量。在细胞分离和扩增完成后，会确定Treg的表型特征。在扩增之后，会对Treg产品的抑制功能进行体外抑制实验评估。符合放行标准的Treg终产品才会被输注到患者体内进行治疗。
图1. Treg过继细胞疗法（TRACT）生产方法学
分离方法
免疫磁珠分离（Immunomagnetic separation, MACS）和荧光辅助细胞分选（FACS）是两种在多数临床试验中常用的Treg分离方法。
MACS使用封闭系统，如Miltenyi Biotec公司的CliniMACS系统进行操作，一般先通过白细胞采集术（leukapheresis）从供体/患者身上收集单个核细胞。接着，用单步法或双步法分离Treg。单步法中，直接正向选择CD25+ T细胞；而在双步法中，先正向剔除CD8+和CD19+细胞，然后正向选择CD25+细胞，以获得CD4+CD25+ T细胞。单步分离后得到的CD4+CD25+ T细胞纯度通常较低（中位数小于70%），而双步分离过程的纯度较高（平均值大于90%）。在不同研究中，经CliniMACS双步分离后得到的CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞纯度分别为69.2 ± 13.9%和约40%。CliniMACS整个处理过程耗时约6小时。
在FACS中，首先通过Ficoll密度梯度离心法从血液中收集单核细胞，或通过MACS富集CD4+ T细胞。接下来，利用CD4、CD127和CD25表面标志物对细胞进行FACS分选，从而获得CD4+CD127lo/-CD25+ T细胞。分选结束后，CD4+CD127lo/-CD25+ T细胞的纯度可达98%之高。若结合免疫磁珠法与FACS分选，则分离出的CD4+CD127lo/-CD25+Foxp3+ Treg细胞纯度可超过95%。然而，FACS分选的整个处理流程耗时较长，通常需要超过20小时。
两种分离方法各有优劣：免疫磁珠分离法操作相对简单快捷，只需几小时即可完成处理，且其封闭系统操作方式无需符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施；但因受限于可使用的表面标志物数量，CliniMACS分离出的Treg纯度相对较低。而FACS由于其操作复杂、耗时长，往往限制了可分离出的Treg数量；并且FACS作为一个开放系统，不符合GMP规定，因此需要在GMP实验室条件下进行细胞分选。
尽管FACS分选后细胞纯度极高，但由于富集和染色步骤中多次离心所导致的细胞损失，最终细胞回收率一般不超过80%；FACS目前只被批准应用于早期临床研究阶段，每项研究都需要单独审批。尽管CliniMACS分离出的细胞纯度相对不高，但其已被批准在日常临床实践中使用，因此，在临床研究中，CliniMACS比FACS更常用。
扩增方法
分离出来的Treg（CD4+CD25+Foxp3+或CD4+CD127lo/−CD25+Foxp3+）通常会在体外使用抗CD3/CD28微珠以及高浓度的IL-2（300/1000 IU/ml）进行扩增。根据初次分离得到的Foxp3+细胞纯度的不同，有时还会在培养过程中加入如雷帕霉素等免疫抑制剂，以抑制分离混入的效应T细胞增殖。通过多重标志物如CD4、CD127、CD25、CD8、CD20、Foxp3、CD45RA、CD45RO、CD38和CCR7来确定扩增后Treg细胞的纯度和表型特征。此外，有研究还测定了与Treg免疫调节功能相关的表面分子（如CTLA-4、CD25、LAP、CD62L、CD27、CD39）的表达水平。
质量检测
治疗检测包括体外测试扩增完的Treg的抑制活性。评估Treg细胞在与效应CD4+ T细胞共培养体系中，以较低的Treg/效应T细胞比例时，能否有效抑制效应T细胞的增殖，以此判断制备好的Treg产品的功能性品质。理想状态下，制备的Treg产品应在Treg:效应T细胞（Teff）比率为1:2时，至少能抑制50%的效应T细胞。同时，最终的Treg产品还需满足其他释放标准，如确保高水平的抑制活性（≥85%）、CD4+比例高（≥95%）、>70%−90% CD4+CD25+、其他细胞污染低（≤5% CD8+或<10% CD8+和CD19+）等。
Treg过继细胞疗法（TRACT）临床研究及评估
在撰写该综述的时候，该文作者在PubMed数据库中用“过继转移调节性T细胞（adoptive transfer regulatory T cell）”这一关键词进行文献检索，出现3,848篇相关结果。该综述作者排除了未讨论临床试验的论文，初筛出50篇相关文章，并补充收集了29份资料。这些文献随后按照相关性进一步筛选，最终将12项试验纳入该综述。表格1列出了每个试验的背景和方法学内容，涵盖了所使用的Treg的数量和表型特征，以及细胞的分离和扩增。表格2描述了各个研究的获益和风险。
表1. 采用Treg的过继细胞疗法（ACT）及方法学关键细节
表2. 采用Treg的过继细胞疗法（ACT）和临床结果
Treg积极的临床结果包括：在移植与GVHD研究中，Treg能降低GVHD发病率，能够消除慢性GVHD的发生，增强对病原体的免疫力，促进免疫重建，同时还能减少GVHD患者以及实体器官移植患者对免疫抑制治疗的需求；在7项移植与GVHD研究中，有4项报告了不良事件。在自身免疫性疾病中，Treg能在1型糖尿病患者中提高C肽水平、减少或消除胰岛素用量；在克罗恩病患者中降低活动指数；在一名系统性红斑狼疮患者中降低分泌IFN-γ的CD4细胞的数量；在这5项研究中，仅有克罗恩病试验报告了不良事件，而且大部分不良事件与消化道紊乱相关，包括便秘、克罗恩病发作、恶心、呕吐、腹痛以及内部疝气等。
尽管这些临床试验结果令人鼓舞，但此类疗法研究中存在一些局限性。首先，Ⅰ期和Ⅱ期临床试验的样本规模通常较小，这限制了所得结论的广泛推广性。其次，患者特征和治疗效果也有不足之处。在某些试验中，较高的死亡率和较短的随访时间削弱了评估长期疗效和安全性的确切性。因此，为了确证Treg细胞疗法在更大范围患者群体中的长期安全性和有效性，还需要开展更多大规模随机对照试验。此外，Treg的最佳剂量和输注时机仍需进一步评估。有研究指出，随着Treg细胞剂量增加，可能出现治疗效果减弱的风险。
为克服当前应用Treg疗法的瓶颈，下一个研究前沿方向是改进Treg的制备和输入策略。研究人员正在探索如何从较少的起始细胞中改良Treg疗效，力求更好地识别并分离出功能健全的Treg、抗原特异性Treg，及制备CAR-Treg，以期获得功能更强、活性更持久和更精准地迁移至靶器官的Treg。
往期推送：
《CAR-Treg在移植中的治疗应用》
作为治疗自身免疫疾病和GVHD的方法，Treg疗法与IL-2疗法各有优缺点：Treg疗法因其高度特异性而受到关注，但其生产过程中的细胞分离和扩增难度较大，且其可能误抑制有益免疫反应；而IL-2疗法虽易于获取和实施，但其可能存在脱靶效应而激活除Treg外的其他免疫细胞。因此，头对头对比这两种方法是有必要的。
尽管FACS和MACS各有优势，但也存在成本高昂（超过10万美元）和设备庞大等问题，限制了符合GMP要求的大规模生产设施的生产能力扩展。研发成本更低廉、快速且易于规模化生产的微流控系统可能可以提高Treg的制备效率。
结论
过去二十年间，TRACT作为一种有巨大潜力的免疫治疗方法崭露头角。Treg已改善了自身免疫病和存在移植排斥风险的患者的生活。我们期待未来对TRACT的改良能使之更好地发挥正面的免疫抑制潜能。
参考文献：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11003444/
Abhishek K, Nidhi M, Chandran S, Shevkoplyas SS, Mohan C. Manufacturing regulatory T cells for adoptive cell therapy in immune diseases: A critical appraisal. Clin Immunol. 2023 Jun;251:109328. doi: 10.1016/j.clim.2023.109328. Epub 2023 Apr 20. PMID: 37086957; PMCID: PMC11003444.
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