2024-12-26
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2024-09-26
2024年12月，Nature杂志发表题为Central control of dynamic gene circuits governs T cell rest and activation的研究论文，通过CRISPR筛选，揭示表观调控基因MED12 是 T 细胞静息和激活的核心调控基因，为免疫治疗提供借鉴价值。本文通讯作者是Jonathan K. Pritchard和Alex Marson。
Jonathan K. Pritchard是斯坦福大学遗传学系和生物学系教授，专注于使用统计学和计算生物学的方法研究基因组学和进化生物学问题。Alex Marson是 Gladstone-UCSF 基因组免疫学研究所所长和创新基因组学研究所人类健康主任，实验室专注于将 CRISPR 技术应用于人类免疫细胞，以了解控制免疫细胞功能的基因程序并操纵 T 细胞进行免疫治疗。跟生信女神刘小乐教授团队的研究策略很相似。
在免疫治疗中，受体和关键分子表达具有细胞特异性和背景特异性，但调控这些编码基因条件性表达的调控网络尚不清楚。Treg和Teff功能对立，但二者基因表达高度相似，且共享一套环境信号。IL-2驱动Treg和激活Teff的细胞适应性，二者对IL-2的竞争在免疫反应起重要作用。IL-2的受体是IL-2α。对于Treg，IL-2α在静息时高表达，在激活时略微上调；但对于Teff，IL-2α在静息时持续低表达，在激活时短时间内上调表达。研究IL-2α在细胞类型特异性和背景特异性方面的基因调控机制，对临床免疫治疗具有重要的借鉴意义。
论文整体框架，思维导图
1、背景特异性IL-2α调控分子的筛选。研究团队首先通过CRISPR筛选技术对T细胞IL-2Rα的上游调控因子，筛选出100多个在不同细胞类型和刺激条件下影响IL-2Rα表达的特异性转录因子(Fig1b），其中有16个是共有的调控因子（12个具有相似的效应），展现出IL-2Rα上游调控网络的复杂性。
2、IL-2Rα的动态调控。为了验证和表征CRISPR筛选中细胞特异性的基因调控作用。研究人员通过敲除18个基因，分析对Treg和Teff中IL-2Rα的影响。其中，敲除MED12后，静息Teff会上调IL-2Rα表达，而在刺激后的Teff和Treg则下调IL-2Rα。通过阵列式敲除实验，研究人员揭示了调控IL-2Rα从激活状态到静息状态的过渡。特别是在Teff细胞中，某些因子如TAF5L、BPTF和SOCS3在细胞返回静息状态时减少了IL-2Rα的表达。
3、Perturb-CITE-seq分析控制 T 细胞静息和激活的调控网络。研究人员推测调控因子不仅限于通过IL-2Rα，而是在全局上调控 T 细胞。因此，研究者使用Perturb-CITE-seq（CRISPR干扰技术敲低基因，同时结合单细胞RNA-seq和表面蛋白组学），评估这些基因对 T 细胞激活的影响。结果表明，许多调节IL-2Rα表达的因子，实际上是全局性地调节 T 细胞的激活状态。而MED12是一个关键因子，在静息和激活状态之间发挥动态调控作用。细胞状态的调节因子通常以调控网络的形式互相影响。
4、MED12是控制IL-2Rα核心调控因子。研究人员通过敲除MED12基因并进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）来进一步探讨MED12对基因表达的动态调控机制。结果表明，缺乏MED12时，CD4+ T 细胞无法完全恢复到休眠状态，也无法达到最大激活水平，而是在一个中间状态中存在。MED12是Mediator复合体的关键组成部分，具有抑制功能，能够防止Mediator与RNA聚合酶II结合，从而调控转录过程。通过敲除不同的Mediator亚基并进行bulk RNA-seq，研究人员发现MED12和核心Mediator亚基（如MED11、MED14、MED31）常常表现出相同方向的效应，且这些基因与MED12调控的基因具有正相关。
5、MED12塑造染色体景观，促进细胞特异性和刺激信号特异性的调控。通过静息和活化Teff细胞中进行内源性免疫沉淀质谱实验（IP-MS），研究人员鉴定到203个MED12重要互作分子，包括Mediator复合物的所有成员。MED12与COMPASS复合物的相互作用可能影响H3K4甲基化的分布，尤其是H3K4me3，这与基因表达密切相关。MED12敲除导致H3K4me3的显著变化，尤其在基因启动子区域，MED12通过促进H3K4me3的分布调控基因的条件性表达。CXXC1与MED12共定位于多个关键调节基因区域，可能在调节这些基因的表达中起着重要作用。H3K4me3的丧失与RNA聚合酶的停顿增加相关，MED12缺失导致在休眠和刺激状态下的停顿模式变化，从而影响基因的转录活性。此外，MED12通过调控KLF2和MYC等基因的表达，发挥着背景特异性的调控作用，并参与广泛的调控网络。
6、MED12敲除限制激活诱导的 T 细胞凋亡。MED12敲除对CAR-T细胞的影响：MED12敲除改善了CAR-T细胞的适应性和存活能力，尤其是通过减少激活诱导的细胞死亡（凋亡）。敲除后，MED12靶向细胞的增殖能力在静息状态下略有增加，但在刺激状态下显著下降，表明减少的激活反应有助于提高细胞的耐久性。
小思考：CRISPR文库筛选一直是国自然热点，通过文库筛选出关键基因并进行深入分析。其他基因筛选思路包括：测序、基因敲除、引药入疾等。芒果师兄之前已经出过多期推文（又是CRISPR！顶刊Cell的基因筛选思路！），而新技术Perturb-seq则让CRISPR筛选得以在单细胞层面上进行细胞特异性和背景特异性的分析。值得借鉴的是2024年6月Cell杂志发表通过Purturb-map揭示卵巢癌IL-4是促进免疫逃逸的关键因素，CRISPR筛选结合空间转录组学，揭示肿瘤异质性(Cell揭秘卵巢癌免疫逃逸新机制：关键竟是IL-4) 。这些新技术是冲击顶刊的有力工具，有条件的小伙伴可以速速借鉴上车。
