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食品工业中的主要香料和香精目前通过化学合成生产，作为人工香料或天然相同香料，但这些并不环保。本综述提供了一个广泛的概念，即这些香料和香精可以通过使用酶/全细胞（生物催化）、发酵（微生物代谢物生物合成）、从农业废料和植物细胞生产香料等方式自然生产。生物合成提供了大量具有樱桃、杏仁、草莓、菠萝、奶酪、洋葱和葡萄风味的化合物。 它们主要使用生物催化剂合成，如脂肪酶、羧酸酯酶、水解酶和蛋白酶。风味的生物合成是环保的，具有特定的选择性（区域选择性、对映选择性），废物可以轻松回收，并且可以在温和的反应条件下生产，如室温、中性pH值和无溶剂环境，相较于化学合成。采用这种天然生产的风味将有益于人类健康，并创造无化学物质的环境。关键词：风味，香精，生物转化，农业废物，天然合成，生物催化。
介绍
香料在食品行业中建立了一个很好的平台。这很重要，因为消费者的需求，如果没有香料，消费者对食物的热情将会消失。含有人工和合成香料的食品大多被避免，因为消费者怀疑这些香料成分对他们的健康有害 [1]。![]()
大多数食品香料化合物是通过化学合成或从自然资源中提取的。然而，最近的市场调查分析表明，消费者也更喜欢标有“天然”标签的食品 [2-5]。由微生物产生的天然香气最终被认可为天然且安全的 [4-6]。此外，化学合成的香料往往会导致不环保的生产过程，还会降低底物选择性，这也可能导致不良副产品的形成，从而降低工艺产量并增加下游成本。另一方面，直接从植物中提取香料的生产也面临各种问题。这些原材料通常含有所需化合物的浓度较低，使得提取过程更加昂贵。这两种方法的缺点以及对天然产品日益增长的兴趣需要管理许多对寻找其他策略以生产天然风味的研究[5-9]。如今，由于消费者倾向于天然香料而非化学香料，许多研究人员和行业已经转向生物催化香料合成。这些反应使用非常温和的操作技术，具有高特异性，减少了副反应，并通过避免更昂贵的分离技术，生产出纯度良好的香料化合物 [10]。鉴于天然香料生物生产的新兴概念，“天然”一词在美国和欧洲都有解释 [11,12]。![]()
在美国，天然和人工香料化合物之间有明显区别，根据《联邦法规汇编》（1990年），“天然香料”是指从香料、水果汁、食用酵母、草药、蔬菜或蔬菜汁、植物的部分（如芽、树皮、根、叶）或类似植物材料、肉类、家禽、海鲜、鸡蛋、乳制品或其发酵产品中提取的具有香味成分的精油、香精或提取物、油树脂、蛋白水解物、蒸馏物，其在食品中的显著功能是赋予香味而非营养。尽管这些化合物的生物催化方法通常成本较高，但已描述了不同的应用。生态友好的条件和高化学选择性使生物催化方法具有吸引力。应研究两个独立的领域：（i）香料化合物的工业生产和（ii）选定香料的学术合成（合成不用于工业生产，而主要用于科学兴趣）。与第一种情况相关的应用很少，其中主要使用分离的酶、发酵产品、生物转化。脂肪酶是最受欢迎的催化剂，因为它们表现出显著的化学选择性、区域选择性和对映选择性[13,14]。此外，它们在大规模上易于获得，并在有机溶剂中保持活性[15]。用于合成食品香料的酶某些技术，如酶封装和最终的辅酶再生，可能导致高效且特异的生物催化过程用于香料合成。一个先进的例子是利用NADH + H+依赖的酵母醇脱氢酶将1-苯基-2-丙酮转化为(S)-1-苯基-2-丙醇；通过偶联反应获得NAD+再生，反过来，甲酸被甲酸脱氢酶转化为气态CO2 [8,16]。这种将1-苯基-2-丙酮转化为(S)-1-苯基-2-丙醇的过程是通过NADH+H+依赖的酵母醇脱氢酶进行的（图1）。![]()
图1. 使用醇脱氢酶生产(S)-1-苯基-2-丙醇
具有樱桃和杏仁味的苯甲醛可以通过氰苷苦杏仁苷生产，该苷存在于樱桃核和杏仁粉中，使用β-葡萄糖苷酶和扁桃腈裂解酶（图2）[8,17]。![]()
图 2. 通过酶 β-葡萄糖苷酶生产苯甲醛
另一个工业实例是L-薄荷醇的生产，它是薄荷油的主要成分。如图3所示，已经发现微生物脂肪酶可以优先水解L-薄荷酯（从DL-消旋混合物中）成L-薄荷醇，而D-薄荷酯保持不变[8,17]。![]()
脂肪酶：在不同的酶中，脂肪酶是用于风味开发最广泛使用的酶。脂肪酶用于有机溶剂中的酯化反应，以生产风味酯（图4），如醋酸异戊酯（香蕉）[18]、丁酸异戊酯[19]、醋酸香叶酯（玫瑰）[20]、醋酸香叶酯（柠檬）[21]。![]()
图4. 通过酯化生产香料
脂肪酶催化的香味酯的生产通过酯化反应受到多种酯化因素的影响，如醇的摩尔浓度、水的添加、搅拌速度、温度和固定化酶的量 [22]。基于消费者对天然香料的偏好，香味酯如醋酸辛酯和丁酸甲酯的生物合成是通过固定化脂肪酶介导的无溶剂条件下的酯化反应完成的 [22]。如今，醋酸丁酯作为一种菠萝香味剂已广泛应用于食品、饮料、化妆品和制药行业。在本研究中，醋酸丁酯作为一种香味酯通过酶促反应路线的绿色合成成功合成。许多研究论文表明，使用固定化脂肪酶脂质体 RMIM (Rhizomucor meihei) 作为生物催化剂，在无溶剂系统中合成菠萝香味的醋酸丁酯。香料酯通常由来自各种优质来源的脂肪酶在有机溶剂中生产。然而，溶剂毒性和高生产成本是大多数反应中的主要问题 [23]。主要目标是合成香料酯，并更好地理解反应化合物及其可变参数（温度、酶量和反应时间）之间的关系 [24]。戊酸乙酯（青苹果香味）、丁酸乙酯（菠萝香味）和醋酸异戊酯（香蕉香味）是通过脂肪酶酯化合成的 [23]。固定化脂肪酶用于上述研究，主要从Candida rugosa和猪胰腺中获得 [24-26]。羧酸酯酶：这些酯类化合物的挥发性在赋予产品确切的风味和香气方面起着重要作用。例如，特定的酯类化合物负责风味，如乙酸酯，它赋予香蕉细腻的风味。这些乙酰酯酶化合物产生的气味更像是花香或果香，乙酸酯的挥发物由浓缩醇产生，有助于特定产品的特征香气。在番茄的情况下发现挥发物的负相关性，研究结果未能通过酯酶产生番茄风味。通过这种酯酶合成未能实现番茄的糖、酸和挥发物的存在 [27]。许多其他微生物酶的固定化也导致了优质香料的生产（例如米根霉）。为了获得香蕉香味地衣芽孢杆菌S-86酯酶。负责香蕉特有香味的酶被命名为酯酶II，这种酶来自地衣芽孢杆菌的胞外表面。地衣芽孢杆菌通常在酶生产方面具有优势，因为它被普遍认为是安全的（GRAS）[26,28]。据称大豆脂氧合酶能够将丁香酚和松柏醛直接转化为香兰素。发酵过程的优化使得水平超过1 g dm-3 [73]。水解酶：酶能够催化酯键的水解，例如在甘油三酯的情况下，植物油是脂肪酸和甘油的组合。因此，在非水系统中，当与酸或醇混合时，水解酶将形成酯。使用这种方法合成的各种香料化合物包括丁酸乙酯、丁酸异丁酯、丁酸异戊酯等 [29-31]。蛋白酶：酶负责酱油、鱼露、纳豆、天贝和味噌中的风味产生。蛋白酶酶的酯化和酯交换反应将产生风味。蛋白酶介导的水解用于生产独特的蛋白水解物，这将增强并增加食物的风味，特别是咸味风味。蛋白质羟基化风味的主要缺点是会导致苦味，这种苦味可以通过在真空下水解来控制 [31-33]。蛋白酶处理小龙虾加工的副产品可以提高苯甲醛和吡嗪等香料的浓度。这些研究还通过在酸性pH下加热蛋白质化合物，负责生产咸味香料[6,34,36]。蛋白酶也负责酶改性奶酪风味的生产。蛋白酶的风味增强作用比天然奶酪生产高出30倍[6,37]。其他酶：几种酶也可以产生和谐的香味，其中从Lactobacillus kefir获得的固定化醇脱氢酶用于从乙酰苯合成(R)-苯基乙醇。从细胞色素P450单加氧酶类型获得的羟化酶被发现参与诺卡酮（一种葡萄香味）的生产。胺氧化酶参与从A. niger生产香草胺。在固定化酶技术中可以进行连续生产[6,38,39]。L-谷氨酸是负责酱油特有风味的成分，来自微生物谷氨酰胺酶，是食品工业中的天然风味增强剂[6,40,41]。![]()
通过发酵合成香料
通过发酵生产香料的最常见方式是奶酪、葡萄酒和其他酒精产品。来源多样，包括细菌、酵母和霉菌（真菌）。有时这种发酵也可能导致某些对人类有益的细菌如乳酸菌的生长。风味的开发，有时甚至是异味的产生，也可以通过发酵实现。葡萄在葡萄酒的生产中起着重要作用，并在发酵时赋予其独特的风味。酿酒酵母是最常用的微生物之一[44]，而白色革盖菌与苹果渣作为碳源一起用于通过香气提取稀释分析（AEDA）和气味活性值（OAV）方法来决定葡萄酒的风味和香气变化。通过嗅闻样品进行香气提取稀释分析以发现异味。这种异味是通过担子菌（白色革盖菌）的从头生物合成实现的 [45,46]发酵也会导致细胞内酶或代谢物的合成。在这种情况下，常见酵母酿酒酵母被发现能为啤酒产生水果香味。这种水果香味是通过挥发性酸和酯化过程获得的，其中挥发性酯的形成伴随着发酵介质中的溶解氧和乙酰辅酶A。脂质含量主要负责酯化过程。负责水果香味的两种酯是醇乙酰转移酶I和II。除了酵母，真菌也可以通过发酵过程将化合物转化为香料。香兰素的生产遵循两种工艺。最常见的真菌之一是黑曲霉，它在担子菌的帮助下将阿魏酸转化为香兰素。负责转化的两种担子菌是朱红密孔菌或白腐菌，它们可以进一步将发酵转化为香兰素的形成。合成香兰素的另一种方法是通过丁香酚的生物转化经由阿魏酸、阿魏醛或松柏醛，由节杆菌、棒状杆菌或假单胞菌菌株完成。细菌似乎比酵母更能将丁香酚转化为香草酸假单胞菌菌株能够有效地将阿魏酸转化为香草酸，而一种链霉菌菌株将阿魏酸转化为香兰素的水平高达6.4 g dm-3.2 [8]。丙炔苯，一种常见的苯类芳香化合物，通过微生物转化变成一种有用的香料。尽管这种丙炔苯对大多数微生物有害。最近的研究表明，某些微生物可以通过自然合成将其转化为一种潜在的香料。各种芳香化合物的生产如香兰素、香草酸、茴香醛、松柏醇、松柏醛可以通过丙炔苯在环氧化物-二醇途径中的生物转化来实现。这是重要产品生物合成的第一步， viz.，香兰素、松柏醇、松柏醛等。这些微生物包括：曲霉菌、红球菌、棒状杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、沙雷氏菌、芽孢杆菌和节杆菌物种。表-2总结了通过各种微生物发酵过程产生的香料。![]()
图5显示，阿魏酸、香草酸或松柏醇是由假单胞菌 HR199和Rhodococcus opacusPD630催化的丁香酚生物转化的主要产物。为了提高香兰素的产量，引入了代谢工程。从P. simplicissimumCBS170.90中提取的香草醇氧化酶基因(vaoA)在R. OpacusPD630和Amycolatopsis sp.HR167中表达，同时从假单胞菌HR199中提取的松柏醇脱氢酶(calA)和松柏醛脱氢酶(calB)基因也被表达。重组菌株随后将丁香酚转化为阿魏酸，后者可以转化为香兰素[47]。![]()
图5 通过发酵生产香兰素
从农业废料中生产香料
通过使用香兰素植物豆荚从香草豆中合成香兰素。这通过能够将前体如阿魏酸转化的微生物的帮助下产生。木浆工业的材料废料被用作从木质素生产生物香兰素的潜在来源。研究 [48] 表明，来自农业废料的阿魏酸可以通过生物转化过程用于生产香兰素。这种农业废料被称为木质纤维素废料，包含纤维素、半纤维素和木质素。生物香兰素也可以通过在阿魏酸的生物转化过程中产生在一个10升的生物反应器中，经过17种底物输入后，Amycolatopsis sp.或Streptomyces setonii的发酵。[49]一个两步过程，涉及在Aspergillus niger的帮助下将阿魏酸转化为香草酸，然后由朱红密孔菌或白腐菌转化为生物香兰素。另一项研究使用了Aspergillus niger酶，后来被鉴定为果胶酶，用于从甜菜浆中释放谷物麸皮中的阿魏酸。谷物麸皮用于通过细菌菌株E. coliJM109 (pBB1) 的生物转化生产阿魏酸通过插入假单胞菌荧光素BF13的功能基因，已经对其进行了基因工程改造，以便从阿魏酸生产香兰素。其他农业副产品，如米糠，在中国的稻米精炼工业中每年生产超过10,000,000吨，也大量产生阿魏酸（图6）。除了在谷物细胞壁中酯化到杂木聚糖的阿拉伯呋喃糖残基[50]，阿魏酸还在米糠油的废渣（粗糠醇）中以环阿坦醇、24-甲烯环阿坦醇、豆甾醇、β-谷甾醇和环阿坦醇的酯化阿魏酸混合物的形式被发现[51,52]。表-3总结了通过农业废料生产香料的方法。![]()
图6. 从米糠油废料中生产阿魏酸
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甜菜粕产生阿魏酸，这是糖精炼工业中香兰素的前体，同时也用于饲养牲畜，发现其含有大量的半乳糖醛酸（< 2 g/kg）、阿拉伯糖（< 2 g/kg）、鼠李糖（< 2 g/kg）和阿魏酸（< 0.8 g/kg）。棕榈油行业也在从阿魏酸生产生物香兰素方面贡献了一份力量。棕榈油精炼工业的废水中含有棕榈油厂废水和水。因此，这可以作为在商业行业中替代化学合成香兰素的潜在来源 [53]。木薯加工单位能够产生水果香味。加工过程中产生的甘蔗渣作为工业废料被用于潜在的香味和香料生产。 水果香气的产生是通过Ceratocystis fimbriata在固体培养物中实现的。这种香味的主要生产操作是通过固态发酵进行的。木薯渣与大豆或苹果渣结合使用。这种组合产生了强烈的水果香气。小麦麸皮、木薯渣和甘蔗渣在Ceratocystis fimbriata的帮助下被发现能产生水果香味。在固体培养基中添加葡萄糖会产生强烈的香气[54]。从农业废料中生产阿魏酸的另一种方法是使用小麦麸皮。通过添加木霉和A. niger对小麦麸皮进行去淀粉处理。这影响了释放阿魏酸所需的木聚糖酶的生产[50]。如图7所示。![]()
利用植物细胞生产香料
主要的植物来源和植物材料含有许多化合物，如精油和香精。一些重要的水果成分，如呋喃酮和吡喃酮，是从许多树种的树皮和叶子中获得的 [55-57]。这些是碳水化合物衍生的香味化合物，具有轻微的气味特征，这是由于存在一组不常见的香味分子，其气味阈值异常低 [53]。呋喃酮主要存在于水果部分，而吡喃酮则从植物种类如落叶松、异叶五加、红叶树和四种松科植物的树皮和叶子中获得 [58,59]。呋喃醇是另一种香味化合物，其生产方式与呋喃酮相似。呋喃醇在水果中产生吸引人的关键香味方面起着重要作用 [60]。一种最常见的香料化合物，同时也是治疗人类多种疾病的生物活性化合物，是萜类化合物。薄荷生产大量具有商业价值的薄荷醇和营养丰富的精油，这些精油是从主要化合物p-薄荷烷单萜中获得的[56]。甜罗勒（Ocimum basilicum）的腺毛富含苯丙烯类化合物以及单萜和倍半萜 [62]。因此，萜烯在商业上可获得，并广泛用作香料化合物、杀虫剂、香水、抗菌剂，最重要的是用作制造维生素和许多其他化学品的原料。许多萜烯在营养保健品和制药行业中不断用于生产抗疟疾和抗逆转录病毒剂 [56,63]。工业生产香料的商业化始于从肉桂中生产肉桂醛化合物和从苦杏仁油中生产苯甲醛，这种植物中的单一化学物质负责整个特征风味和香气 [51,59]。 葡萄柚中含有一种名为诺卡酮的精油成分，它源自于瓦伦烯，在葡萄柚的风味和香气中起着主导作用。这赋予了水果特有的香气[64]。而单萜在草莓风味化合物的生产中起着重要作用。这种化合物是负责风味的成分[65,66]。一种木质香气来自一种热带草本植物，称为香根草，学名为Chrysopogon zizanioides，用于生产精油。β-香根草酮是负责植物特有木质香气的生物活性化合物，它是香根草油中的关键成分之一[67,68]。香草胺也由天然的胡椒和辣椒成分制成[6,38,39]。产生香味的几种植物细胞和部分在表-4中总结。
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参考文献
Poornima, K. & Preetha, Radhakrishnan. (2017). Biosynthesis of Food Flavours and Fragrances - A Review. Asian Journal of Chemistry. 29. 2345-2352. 10.14233/ajchem.2017.20748.
