研究人员与农民合作，探寻世界顶级可可发酵背后的微生物和分子。可可研究中心的研究员达林·苏卡（左）与可可种植户拉姆拉杰·拉姆迪亚尔在金豆庄园的晾晒场上讨论可可豆的采样事宜。图片来源：可可研究中心。维贾伊·贾加萨尔（Vijay Jagassar）形容他在特立尼达种植园生产的可可豆“色泽深沉，带有木质味，巧克力味浓郁，还略带花香”。2021 年，这种独特的风味组合使他的产品在特立尼达和多巴哥全国可可奖评选中进入决赛。与被赫尔希（Hershey）和吉百利（Cadbury）等公司用于生产巧克力棒的普通可可豆不同，贾加萨尔生产的是一种风味独特的优质巧克力，因其独特的风味而备受追捧。贾加萨尔是一名工程师，2018 年从休斯敦回到他的家乡特立尼达，他知道自己想要以更科学的方法生产优质巧克力，于是联系了西印度群岛大学的可可研究中心（CRC）。贾加萨尔的种植园成为参与 CRC 项目研究可可豆发酵过程（将生可可豆转化为丝滑可可豆的自然数天过程）如何产生巧克力风味分子的农场之一。用于生产优质巧克力的可可豆售价要高得多：每吨 5500 至 6800 美元，而占市场 90%份额的普通可可豆售价为每吨 2500 至 3000 美元。贾加萨尔通过采用“从可可豆到巧克力棒”的模式，仅使用自家的可可豆生产巧克力，一块巧克力就能卖到 13 英镑（约合 15.80 美元）。而且他并非孤身一人。据市场研究公司莫多尔情报（Mordor Intelligence）的一份报告称，未来 5 年，从豆到巧克力棒的市场预计将以每年 7.8%的速度增长。该研究项目是与诺丁汉大学以及最近退休的植物遗传学家大卫·萨尔特（David Salt）合作开展的一个更大项目的一部分，该项目在特立尼达六个农业生态区的八个可可种植园中招募农民作为公民科学家参与其中。作为该项目的一部分，CRC 研究员纳伊拉·阿里（Naailah Ali）于 2021 年与这些种植园合作，观察其可可豆发酵过程。农民们在发酵和干燥过程中监测可可豆堆的温度和 pH 值。他们还冷冻了豆样并将其送往特立尼达的 CRC 实验室。在那里，研究人员确定了在发酵过程中发挥神奇作用的微生物种类，这些微生物将原本无味的可可豆转化为优质巧克力中那种果味、花香、坚果味、奶油味或辛辣味。项目结束时，对最终可可液（由发酵、烘焙和研磨后的可可豆制成的糊状物）进行了感官分析，以确定其风味特征。所有这些数字和感官数据都有助于研究人员对优质风味巧克力发酵背后的化学原理有更深入的了解。其中一部分工作是确定哪些分子对应哪些感官特征。在此基础上，研究人员正在识别甚至尝试逆向工程在发酵过程中制造这些风味化合物的酵母和细菌网络。他们设想了一个世界，在这个世界里，农民可以从微生物库中挑选并定制风味体验。乍一看，苏黎世应用科学大学伊琳娜·切特希克（Irene Chetschik）的食品化学实验室似乎是在人类与机器之间展开较量。实际上，两者是协同工作的。首先，切特希克的团队将巧克力样品汽化，并将其分离成各种成分分子。这些化合物被送入两条不同的路径。一条路径通向进行常规分析的质谱仪；另一条路径通向嗅探口，由人类评估员进行评估。这种技术组合使团队能够识别出巧克力中负责产生评估员闻到的风味的化合物。巧克力的味道比诸如香草这类源自单一分子的味道要复杂得多。萨尔特说：“可可豆里并没有一种分子就是巧克力的味道。”“巧克力的整体风味是由多种化合物构成的‘香氛’，”他还补充道，这取决于可可树（Theobroma cacao）的品种以及特定当地生长环境或风土所支持的微生物群落。![]()
食品化学家伊琳娜·切奇克（Irene Chetschik）正在使用气相色谱嗅觉法分析巧克力香气的成分。图片来源：伊琳娜·切奇克/苏黎世应用科学大学。切奇克一直在使用一种综合了质谱分析和人类评估的方法——被称为气相色谱嗅觉法——来探究在巧克力中检测到的 100 多种挥发性有机化合物（VOCs）。机器和人类提供的数据都至关重要，因为尽管有些化合物对感知到的风味影响很大，但它们的浓度可能低至 5 ppb 以下。“要从分析角度深入挖掘才能找到它们，”切奇克说，但人类的鼻子却能相对轻松地辨别出这些风味。她的实验室已经能够识别出一些具有特征风味的 VOCs。例如，酸味和果味与几种酯类相关，包括2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯；烤可可风味与 2-甲基丁醛、呋喃酮和二甲基三硫醚相关；花香和涩味与多酚类黄酮相关。切奇克发现的化合物数量之多解释了可可发酵过程中复杂风味的形成，也说明了为什么其他研究人员发现发酵过程难以复制或标准化。在一定程度上，巧克力鉴赏家已经将特定风味与特定产地联系起来。哥斯达黎加国立大学研究可可发酵的食品技术专家卡洛斯·埃尔南德斯·阿吉雷表示，秘鲁安第斯山脉西坡的皮乌拉山谷以生产具有花香和果香的巧克力而闻名，而马拉开波湖南部的潮湿地区所产巧克力则带有更浓郁的坚果味。（埃尔南德斯·阿吉雷通常喜欢那种果香清新、带有玫瑰和茉莉花香以及热带水果和葡萄干风味的巧克力。）每个风土环境都包含众多环境因素，其中包括对可可豆发酵过程中形成风味至关重要的当地微生物群落。但研究这些微生物却颇具挑战性。尽管像切特希克这样的研究将风味与单个分子联系起来，但目前仍无法将一种挥发性有机化合物直接与单一微生物种类联系起来。这在一定程度上是因为分解可可豆的微生物之间相互关联，更不用说其种类繁多。基本原理相对比较清楚：发酵始于我们周围随处可见的酵母。它们通过分解可可豆荚中包裹着豆子的果肉中的糖分来产生乙醇。细菌消耗乙醇并产生乳酸，而乳酸又被其他细菌转化为醋酸。随着这一系列细菌消化过程的进行，可可豆会散发出热量。温度的升高以及酸性环境会破坏可可豆的细胞壁，从而使得细胞内的蛋白质以及可可豆中令人感到涩味的多酚得以分解。所有这些化合物随后都会被卷入错综复杂的代谢途径中，这些途径会一点一点地对小分子进行改造，直到可可生产商获得那种复杂而又熟悉的巧克力味道。但发酵是一场微妙的舞蹈。发酵时间过长会导致酸性物质积聚，从而产生酸败或醋味。诺丁汉大学与可可研究合作中心的合作旨在了解并利用协同作用产生特定风味的更广泛的微生物群落。除了从特立尼达的农民那里收集样本外，研究人员还与哥伦比亚的农民合作，在那里他们使用便携式 DNA 测序仪在田间对样本中的微生物进行分类。该团队目前正试图通过将共同作用的微生物的活动联系起来，来理解并模拟其已测序的数百种不同物种之间的关系——实质上是重建多达 30 种菌株相互依存的微型生态系统。在诺丁汉，科学家们建立了一个由 500 种微生物组成的库，并正在测试其分析表明能协同产生可可风味的较小分组的发酵情况。一旦该系统得到验证，他们计划在每个组中添加或移除微生物以突出某些口味。萨尔特称这种方法为“精准发酵”，并表示希望它能提供关于哪些微生物网络能产生哪些风味的完整信息。该团队希望很快发表其研究成果。但其他研究人员，比如埃尔南德斯·阿吉雷，正在寻找更快的解决方案。他的团队专注于在发酵过程中提供关键启动作用的酵母。研究人员需要优化发酵的早期阶段，为微生物群落的其余部分创造条件，使其繁荣发展并产生所需的风味。赫尔南德斯·阿吉雷与比利时的合作者一起，利用从可可豆自然发酵过程中分离出的酵母进行了几项研究。在他们最近的一项研究中，他们对两种酵母进行了比较，发现酿酒酵母（用于改善啤酒和葡萄酒风味的酵母）能生产出香气更浓郁且更稳定的可可液。他们测试的第二种天然酵母无法战胜其他微生物，无法在发酵过程中占据主导地位，这导致发酵不足，产生了更多苦涩的多酚。“目前我们正在努力扩大规模，并尝试将这项技术转让给农民，”赫尔南德斯·阿吉雷说。但他提醒说，在实验室条件下获得的结果并不总是能适用于农场上更难以控制的环境。诺丁汉大学-可可研究联盟团队和赫尔南德斯·阿吉雷都在努力应对自然发酵过程中涉及的大量微生物种类。即使是一些看似不起眼的微生物，也可能在分解化合物方面发挥重要作用，这些化合物如果不被分解，可能就不会转化为风味分子。去除微生物回到瑞士这个有着生产优质巧克力传统的国度，切奇克采取了一种非传统的做法。“发酵很难掌控。它是自发的，不容易控制，”她说。因此，她设计了一个旨在产生浓郁巧克力风味的过程，而无需传统发酵中复杂的微生物网络。切奇克称这种合成技术为“湿热培养”，它从未发酵的可可豆开始，将其碾碎。她通过将可可豆在含有乳酸和乙醇的浆液中加热 72 小时，添加氧气，最后干燥所得的可可粉来模拟发酵过程。“由于我们使用的乙醇浓度，微生物实际上无法生长，”她解释道，因此这种方法比自然发酵更快、更易于管理。通过感官小组对湿热培养法生产的巧克力进行了测试，他们报告说，其香气更果味、更花香、更麦芽味、更焦糖味，但不如传统发酵的可可豆那么有烘烤味。小组成员还表示，这种巧克力的酸味比传统发酵的要少。切奇克表示，扩大这种简化过程的规模应该是可行的。CRC 主任帕斯曼纳坦·乌玛哈兰表示，这种方法“可能在生产特色巧克力方面具有一定的价值”。但他指出，这种方法不太可能在每年生产的 500 万吨可可豆中得到广泛应用，因为如果微生物不能自然产生热量，就必须向系统中输入热量。切奇克的研究颠覆了传统的可可发酵方法，将注意力从微生物代谢在优质风味生产中的作用转移开，转而关注蛋白质水解——即由可可豆中天然存在的酶对蛋白质进行分解。安第斯大学的安德烈斯·费尔南多·冈萨雷斯·巴里奥斯表示，一旦酶水解蛋白质，就会留下肽——短链氨基酸片段，但我们仍不清楚肽是如何对风味产生影响的。在最近一项对已发表数据进行的宏基因组学研究中，冈萨雷斯·巴里奥斯发现优质风味巧克力中的肽种类更多；平均而言，这些肽比用大宗可可豆制成的巧克力中的肽要短。在一项关于发酵温度和肽谱的早期研究中，冈萨雷斯·巴里奥斯（Gonzalez Barrios）发现，在发酵过程建立之后，可可豆会经历一个为期 4 天的阶段，在此期间其温度保持较高且基本恒定。他怀疑这一阶段的高温为酶促水解以及氨基酸、二肽和三肽的生成提供了适宜条件。但冈萨雷斯·巴里奥斯表示，鉴于酶可以从蛋白质中剪切出大量的肽序列，要确定哪些肽对风味影响最大并非易事。“未来我们需要开展大量的‘肽组学’研究，以弄清楚这些序列如何与感官特征相对应。”最终，冈萨雷斯·巴里奥斯希望他的研究能够帮助规范农民的发酵操作，从而提高巧克力的质量。据可可研究中心（CRC）的阿里（Ali）称，大多数可可种植户仍依靠传统的当地做法进行自然发酵。但他认为，这更多是因为缺乏可获取的信息，而非种植户缺乏好奇心。诺丁汉 - CRC 项目“确实引发了大家对发酵过程中所发生情况的兴趣，他们提出了很多问题。”阿里现在正在为参与的农场准备一份通俗易懂的后续报告；特别是，她打算解释农民们所收集的温度和 pH 值数据的重要性，以及他们如何利用这些信息来跟踪发酵的进程。一些农民已经根据他们的研究结果做出了小的改变。“通常，我们只是开始发酵过程，没有进行任何科学测量，”贾加萨尔说。但现在他计划继续监测温度和 pH 值，以帮助确定发酵何时完成以及何时开始干燥。![]()
纳伊拉·阿里在特立尼达和多巴哥格兰库瓦的圣胡安庄园采集样本，这是环境微生物数据收集工作的一部分。图片来源：昆西·温克拉尔/圣胡安庄园。特立尼达农民查尔斯·梅里（Charles Merry）的可可豆在 2015 年“优质可可奖”中排名世界前 50，他也参与了该项目。梅里表示，根据团队收集的数据，他的农场已将传统的 7 天发酵期缩短至 5 天，以避免过度发酵。萨尔特（Salt）称，该项目迄今取得的关键成果之一，是将研究人员在哥伦比亚合作的农民与位于诺丁汉的从可可豆到巧克力棒的制造商路易莎·维辛纳扎 - 贝迪（Luisa Vicinanza-Bedi）联系起来，这使得这些农民能够为他们的优质可可找到新的市场。维辛纳扎 - 贝迪表示，他们最好的巧克力能带来悠长的味觉体验，包括坚果、红果和柠檬的味道。从维辛纳扎 - 贝迪及其商业伙伴马特恩·奥·戴尔（Martyn O'Dare）的角度来看，这些可可豆种植户在控制发酵和适应各种天气条件方面已经积累了相当多的隐性知识。这“都需要技巧，这就是为什么从可可豆到巧克力棒的制造商对他们的优质可可豆来源如此保护，并确保农民因他们的优质产品获得良好报酬的原因。”随着消费者对优质巧克力的需求不断增长，可可研究委员会的乌马哈兰认为，未来巧克力的生产将借鉴葡萄酒酿造工艺，将不同可可品种和当地环境因素与对发酵过程的精准控制相结合，从而产生丰富多样的风味。切奇克对此表示赞同。“可可现在也开始走上同样的道路。前景广阔，但还需要大量的工作和研究。”雷切尔·布里斯托尔是美国化学学会旗下独立新闻机构《化学与工程新闻》的自由撰稿人。Cite this: ACS Cent. Sci. 2023, 9, 10, 1856–1859
https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c01191
Published September 29, 2023
