文献精读：通过合成Notch受体以在空间上控制多细胞构建体分化的工程化可编辑材料-细胞信号通路

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合成Notch（synNotch）受体是一种基因编码的模块化合成受体，使哺乳动物细胞能够感知环境信号并通过激活用户指定的转录程序来响应。虽然一些材料已经被修饰以呈现synNotch配体，但其空间控制仍较为粗略。所以组织工程中的应用通常需要来源于细胞外基质（ECM）衍生的支架和/或多种配体的更精细的空间定位。因此，南加州大学凯克医学院Megan McCain教授和Leonardo Morsut教授（通讯作者）团队在此开发了一系列能够激活synNotch的材料，以实现材料到细胞信号传导的通用工程化。将功能性synNotch配体通过基因和化学方法融合到ECM蛋白和ECM衍生材料中。同时，通过微接触印刷（一种将分子或材料图案转移到基底表面的软光刻技术，常用于表面图案化和纳米结构的构建）培养具有两种正交synNotch程序培养的细胞，在四种不同的报告基因表型上实现了微米级精度的组织生成。最后，展示了在组织工程中的应用，通过共转分化将成纤维细胞转化为骨骼肌或内皮细胞前体，并在用户定义的微模式中实现这一过程。这些技术为在哺乳动物组织中空间控制细胞表型提供了新的途径。

（A）为了评估合成配体提呈材料对synNotch受体的激活作用，首先采用悬浮微粒以半类似于递呈细胞膜上的方法呈现配体。通过EDC/NHS反应将GFP连接到不同直径（2 μm-10 μm）的羧基修饰微粒上，通过简单地调节共轭反应中GFP的浓度，可以负载不同数量的GFP。然后，将这些微粒添加到单层的受体成纤维细胞（L929细胞）中，该细胞被设计成表达激活mCherry报告基因的抗GFP /tTA synNotch受体。左为GFP与微粒结合的示意图，与带有激活mCherry的抗GFP/tTa synNotch的受体成纤维细胞共培养。右为被GFP微粒激活的受体成纤维细胞的荧光显微镜图像。（B）5 μm的微粒与0、100、1000 μg/mL的GFP或GFP分泌细胞结合培养的受体成纤维细胞的荧光显微镜图像。结果显示，随着GFP浓度的增加，受体细胞中mCherry表达显著增加。（C）定量分析了与GFP微球或GFP分泌细胞共培养24小时后，通过图像分析定量mCherry表达受体成纤维细胞的百分比。结果表明随着微球上GFP浓度的增加，mCherry表达细胞的比例显著上升，最高浓度组（1000 µg/mL）与GFP分泌细胞的活化效果相当。这表明微球结合的GFP能够有效激活synNotch受体，与邻近细胞表面的GFP类似。（D）用miRFP（一种近红外荧光蛋白）核标签产生纤维连接蛋白-GFP（FN-GFP）的成纤维细胞与激活mCherry并组成性表达BFP的抗GFP/tTa snyNotch受体成纤维细胞共培养的示意图。供体细胞分泌FN-GFP，形成包含GFP的细胞外基质（ECM），而受体细胞通过GFP激活synNotch受体并表达mCherry。（E）FN-GFP供体细胞和受体细胞共培养3天的荧光显微图像。图像显示，只有靠近FN-GFP供体细胞的受体细胞中mCherry有较高的表达，表明GFP信号在局部有效激活了synNotch受体。这一结果证明FN-GFP嵌入的ECM能够激活邻近区域的受体细胞，且激活具有空间局限性。（F）FN-GFP供体细胞沉积ECM的细胞去核化和重新接种受体细胞示意图。供体细胞培养8天后，去核化处理以去除细胞，仅保留ECM结构，然后将受体细胞接种到这些去核化的基质上。旨在研究不同浓度的FN-GFP在ECM中如何调控synNotch受体的激活。（G）用不同比例（1:0，1:1，0:1）的供体纤连蛋白细胞（FN-parental）和FN-GFP细胞共培养，并去核化后重新接种受体细胞的荧光显微图像。荧光显微图像显示，随着FN-GFP供体细胞比例的增加，受体细胞中mCherry的表达显著增加，尤其是1:1的供体细胞比例时，受体细胞中mCherry表达量最高。（H）受体细胞在纤连蛋白细胞和/或FN-GFP细胞制备的去核化ECM上培养2天后mCherry表达的流式细胞术定量分析。通过流式细胞术进一步定量了不同供体细胞比例下mCherry表达的受体细胞数量，结果表明，mCherry的表达量随供体细胞中FN-GFP比例的增加而增加，表明FN-GFP在去核化的ECM中保持了功能并且能够有效激活synNotch。

（A）通过转谷氨酰胺酶（TG）将带有短C端LACE肽标签（GFP-LACE）的GFP，以提供可接近的赖氨酸残基的GFP-Lys酶联到明胶水凝胶表面以激活激活受体成纤维细胞中mCherry的抗GFP/tTa synNotch的示意图。（B）受体成纤维细胞在0、100和250 µg/mL GFP-Lys标记的明胶水凝胶上培养的荧光显微镜图像。图像显示，在偶联了不同浓度GFP-Lys（0 µg/mL、100 µg/mL、250 µg/mL）的水凝胶表面上，mCherry的表达随着GFP-Lys浓度的增加而增强。这表明偶联到水凝胶表面的GFP能够有效激活受体细胞中的合成受体。（C）在指定浓度的GFP或GFP-Lys标记的明胶水凝胶上培养3天后，流式细胞术定量表达mCherry的受体成纤维细胞的百分比。mCherry阳性细胞的比例随GFP浓度增加而显著升高，最高浓度的GFP-Lys（250 µg/mL）组与没有偶联GFP的水凝胶组相比，mCherry表达显著增加。这表明，合成Notch受体能够被材料表面偶联的GFP-Lys有效激活。（D）明胶甲基丙烯酰-甲基四嗪（GelMA-mTz）共价连接到GFP-反式环辛烯（GFP-TCO），然后用紫外光光封装受体成纤维细胞的示意图。GFP配体能够稳定地嵌入水凝胶基质内部，从而使细胞在三维空间中与配体相互作用。（E）在培养的第1天和第3天，受体成纤维细胞包裹在含有0（GelMA）或50 μg/mLGFP-TCO（GelMA-GFP）的GelMA-mTz水凝胶中，共聚焦显微镜图像的z轴投影和3D视图。在含有GFP的水凝胶中，受体成纤维细胞中mCherry表达显著增强，表明GFP-TCO偶联的GelMA水凝胶可以激活嵌入其中的受体细胞中的synNotch受体。（F）在GelMA或GelMA-GFP水凝胶中培养1、3和7天后，通过图像分析定量Mcherry表达受体细胞的百分比。定量分析表明，MCherry表达的细胞比例在GelMA-GFP组中显著高于未修饰的GelMA组，并且这种激活效应在7天内仍能维持，表明该方法能够实现长时间的稳定受体激活。（G）通过微移技术将受体成纤维细胞封装成双相GelMA/GelMA-GFP水凝胶。（H）双相凝胶GelMA/GelMA-GFP水凝胶中受体成纤维细胞在封装后5天的Brightfield和荧光显微镜图像。（I）标准化mCherry强度在水凝胶长度上的剖面图，在包封后1、2、3和5天。绿色区域表示GelMA-GFP区域。随着时间的推移，mCherry的激活同样在空间上局限于GelMA-GFP区域，这表明GFP配体只在它最初定位的区域与水凝胶激活的synNotch结合。

（A）GFP的原理图和盖玻片制备及微接触印刷。开发了一种微接触印刷GFP方块阵列的方法，这些GFP方块的特征范围为100 µm到1 mm。（B）微接触印刷GFP的图案和相应的荧光显微镜图像。图像显示了用户定义的图案（如方形或条形）及其在微接触印刷中实现的GFP图像，验证了印刷精度和图案一致性。（C）表达mCherry的抗GFP/tTA synNotch受体成纤维细胞在微接触印刷了GFP的基质上培养的示意图。一半的组织是透明的，以显示潜在的GFP模式。印刷的GFP配体将与受体细胞表面的抗GFP synNotch受体结合，激活mCherry表达。（D）（i）微接触印刷GFP的图案和（ii）由此产生的荧光显微镜图像。（iii，iv）受体细胞在GFP标记的底物上培养2天后表达mCherry的荧光显微镜图像。虚线用不同的间隔分隔区域。（iii）及（iv）内的白色实框表示印刷GFP的位置。结果显示，mCherry的表达与印刷的GFP图案精确重叠，这表明synNotch受体在接触到印刷GFP的区域被成功激活。（E）在500 μm边长的GFP方块上，间隔1000 μm，受体细胞培养指定天数后的标准化mCherry强度进行剖面图分析（顶部），以及在250 μm边长的GFP方块上，间隔250 μm进行相同实验（底部）。绿色表示印刷GFP的位置。展示了在不同时间点受体细胞中mCherry表达的空间分布轮廓图。在第2天和第5天的mCherry强度图像中，mCherry表达始终与印刷的GFP区域相对应，表明GFP在接触到的区域有效激活了synNotch受体，并且在不同时间点内激活效果保持稳定。（F）Pearson相关系数通过比较用户定义模式的图像与培养两天后受体细胞mCherry强度的荧光显微镜图像产生。（G）（i）（ii）微接触印刷的GFP和（iii）培养两天后受体成纤维细胞mCherry表达的模式和相应的荧光显微镜图像。（iv）相应的亮视野显微镜图像。（i）显示了不同用户定义的图案（如圆形和字母），（ii）和（iii）是GFP微接触印刷图像及其对应的mCherry表达图像。结果表明，mCherry的表达与印刷的GFP图案一致，展示了该方法在复杂图案设计中的精确控制能力。

（A）表达抗GFP/tTA和抗mCherry/Gal4 synNotch受体的双受体成纤维细胞（L929细胞）在被微接触印刷了GFP和mCherry的表面上培养的示意图。GFP-和mCherry印刷区域分别激活mCherry和BFP报告基因的表达。（B）双受体细胞培养1天后微接触印刷的500 μm宽的GFP和mCherry垂直线以及相应的miRFP和BFP表达的荧光显微镜图像。当接种双受体细胞时，观察到一排排表达miRFP的细胞垂直于一排排表达BFP的细胞。（C）（B）所示区域的高倍荧光显微镜图像。在GFP和mCherry的交点，细胞同时表达miRFP和BFP，表明两条synNotch通路都被激活，为1.5 mm²组织内最初一致的工程细胞群（BFP−/miRFP−、BFP−/miRFP+、BFP+/miRFP−、BFP+/miRFP+）产生了4种报告“状态”。（D）在GFP/mCherry模式上培养一天后，BFP和/或miRFP表达受体细胞的百分比，通过图像分析进行定量。结果发现，在含有单个配体的区域（GFP或mCherry）上，约60-70%的双受体细胞表达匹配的报告基因（分别为miRFP或BFP）。在GFP和mCherry的交点，大约50%的双受体细胞同时表达BFP和miRFP。

（A）带有抗GFP/tTa synNotch的受体成纤维细胞示意图，可在带有GFP的底物上激活mCherry和成肌分化因子（myoD）。（B）在GFP微图案化表面培养受体成纤维细胞3天后，MyoD和肌动蛋白（actin）荧光显微图像显示。MyoD阳性细胞沿GFP图案排列，并诱导肌管分化。当这些受体细胞在均匀印刷GFP的表面上培养时，它们转分化为α-肌动蛋白阳性的肌管。这表明，微图案化的GFP能够有效激活synNotch受体，启动MyoD的表达，进而引导成纤维细胞向肌细胞分化。（C）对于指定的细胞类型和底物，通过批量RNA测序测定基因表达的热图和层次聚类。观察到，在GFP表面培养受体细胞导致3064个差异表达基因。根据层次聚类，GFP上的受体细胞与C2C12肌管最相似。（D）火山图和（E）基因本体论分析+GFP与-GFP的受体成纤维细胞的差异表达基因。GFP上的受体细胞也过表达一些肌肉特异性基因，如Myh2，Myh4和Ttn，并下调成纤维细胞基因的表达，如Col1a1和Pdgfrb。GO-term分析表明，与无GFP相比，与肌肉发育和分化相关的多条通路在有GFP表面的受体细胞中富集。（F）受体成纤维细胞在带有（+GFP）或不带有（-GFP）共轭GFP的微模化明胶水凝胶上4天后的荧光显微镜图像，肌节α-肌动蛋白（紫色）和DAPI（蓝色）染色。（G）受体成纤维细胞在明胶水凝胶底物上4天的成肌指数。（H）在指示+GFP-明胶水凝胶上培养的受体成纤维细胞的肌管方向。在GFP水凝胶上培养的受体细胞转分化为α-辅肌动蛋白阳性肌管，不受表面形貌的影响，并且受体细胞始终与微模脊对齐，不受活化状态的影响。（I）（i）模式和（ii）微接触印刷的荧光显微镜图像，以及（iii）培养3天的受体成纤维细胞。（J）受体成纤维细胞在指定区域培养3天的成肌指数。（K）α- actin免疫信号的取向顺序参数。对于所有的几何形状，GFP上的成肌指数都显著高于GFP下的成肌指数，表明了转分化的局部几何控制。量化了方向顺序参数作为排列的代理，并且仅在直线上观察到组织的排列高于各向同性组织。因此，可以选择性地将成纤维细胞转分化为成肌细胞，同时控制组织的整体排列，表明可以单独和同时控制局部分化和组织结构。

（A）受体成纤维细胞与抗mCherry/Gal4 synNotch示意图，激活BFP和Ets变异体转录因子2（ETV2）时，基质与mCherry培养。（B）受体成纤维细胞在有（+mCherry）或无（-mCherry）mCherry涂层的衬底上培养3天的荧光显微镜图像，并对VEGFR2（中间，绿色）和VE-cadherin（底部，绿色）进行免疫染色。BFP报告基因（顶部，蓝色）和细胞核（紫色，全部）也显示出来。（C）在指示底物上培养3天后，用流式细胞术定量检测表达BFP（左）和VEGFR2（右）的受体成纤维细胞百分比。成纤维细胞转分化为VEGFR2阳性的内皮前体细胞，并且其膜上也表达VE-Cadherin，流式细胞术也在蛋白水平检测到后期内皮标志物CDH5。（D）基因表达的热图和层次聚类，通过批量RNA测序测量，在指示的底物上指示的细胞类型。（E）火山图的受体成纤维细胞的差异表达基因的底物与mCherry比较。与在无mCherry的表面培养相比，在mCherry表面培养的受体细胞产生了3022个差异表达基因。与在无mCherry表面培养的细胞相比，在mCherry表面培养的受体细胞更倾向于与Bend.3内皮细胞系聚集，并且过度表达内皮相关基因，如KDR和CDH5。（F）用于mCherry微接触印刷行的图案，并产生在底物上培养3天的受体成纤维细胞的荧光显微镜图像和VEGFR2的免疫染色（绿色）。BFP报告基因（蓝色）和细胞核（紫色）也显示。（G）y轴上标准化BFP和VEGFR2强度的分布图，红色条形表示以m Cherry为图案的区域。（H）用于制作微接触印刷mCherry成血管样图案，并产生在底物上培养3天的受体成纤维细胞的荧光显微镜图像和VEGFR2的免疫染色（绿色）。BFP报告基因（蓝色）和细胞核（紫色）也显示出来。与肌源性synNotch细胞相似，微接触印刷配体可以通过空间控制激活synNotch诱导的向内皮前体细胞的转分化。

（A）（i）用GFP和mcherry交替排列来制造基板的微流控图型技术示意图和相应微流控装置的照片。通道宽度为500 µm。通过指状排列500 µm宽的排来传递GFP和mCherry的溶液，并通过在3D印刷的反向模板上铸造PDMS来制造。（ii）双系受体成纤维细胞的示意图，带有激活MyoD和miRFP的抗GFP/ tTA synNotch，以及激活ETV2和BFP的正交抗mCherry/Gal4-VP64 synNotch，培养在带有GFP和mCherry图案的相应底物上。（B）荧光显微镜下的GFP和mCherry微流控基质图像，以及双系受体成纤维细胞在基质上培养3天后相应的miRFP和BFP报告基因的表达。过夜孵育后，将PDMS装置移除，剩余的溶液短暂风干，在表面留下交错排列的GFP和mCherry。（C）双系受体细胞在带有GFP和mCherry的微流控基质上培养3天后的荧光显微镜图像，以及α-actinin（红色）和VEGFR2（绿色）的免疫染色。绿色虚线表示由于高饱和度，GFP配体的荧光被减去，以使VEGFR2荧光可见的区域。当双系成纤维细胞在这些表面培养时，培养1天后细胞均匀地贴附在整个表面上。培养3天后，成纤维细胞转分化为成肌细胞或内皮细胞，其模式与预期的配体模式相对应。α-actinin阳性的肌肉前体细胞局限于GFP排，VEGFR2阳性的内皮前体细胞局限于mCherry排，并且在GFP和mCherry之间的界面观察到这两种细胞类型的混合。在无图案区域的细胞仍然是成纤维细胞，尽管其中一些显示出ɑ-辅肌动蛋白（ɑ-actinin）的阳性，表明synNotch myoD通路的某种程度的基础激活。

（A）左：显示在单核测序实验中使用的不同配体模式示意图。右：四种不同模式培养条件下双系成纤维细胞的T分布随机邻接嵌入图结果。成纤维细胞样细胞簇包含7个单独的细胞簇。配体分布的区域仅占培养表面的大约一半。即使在没有配体的条件下，也有一些细胞呈肌肉样簇，这与synNotch myoD通路的高基础激活一致。（B）左：成纤维细胞样细胞、肌样细胞和内皮样细胞在四种模式下的百分比。右：在每种模式条件下，肌样细胞簇占总肌样细胞的百分比。细胞被诱导成仅GFP模式的肌源性谱系和更多的细胞被诱导成仅mCherry模式的内皮谱系。（C）显示不同模式条件下所有簇中所选成纤维细胞、肌肉和内皮标志物的平均表达和百分比。选定的标记基因分析显示，成纤维细胞标记基因在GFP和/或mCherry模式下总体下调。相应的，肌肉特异性基因和内皮特异性基因分别以GFP和（或）mCherry的方式过表达。通过这一分析，还检测到了转基因（myoD和BFP）的预期表达。

本研究开发了一种synNotch受体，以实现对细胞行为和分化的空间控制，进而推动多细胞构造的工程化。通过微图案化技术，研究者成功地将合成配体（如GFP和mCherry）精确地印刷在细胞培养基质上，激活了双受体成纤维细胞中的MyoD表达，诱导其向肌肉细胞分化。GFP配体的浓度和时间对细胞的分化效果具有显著影响。结果表明，合成Notch信号通路不仅可以精确控制细胞分化的空间模式，还能通过调节细胞间的相互作用，增强T细胞功能。该技术为未来组织工程和再生医学提供了新的策略，展现了合成生物学在细胞编程和组织构建中的潜力。

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