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公众号推出的每一篇科研技巧相关文章均由W&H Group的成员在实验过程中所遇所得。旨在分享传播与创伤修复相关的实验技巧，包括造模技巧、实验操作的步骤和技术、常见问题及解决方案等。
简介
冰冻切片（Cryostat sectioning）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度然后切片的组织学技术，以获得薄片用于显微镜观察。由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，能够完好的保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原，因此比较适合手术中快速病理、显示组织中的脂质、显示酶活性和免疫荧光等方面的研究，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。这种方法通常用于病理学、组织学以及生物医学研究。主要有直接冰冻切片法、明胶冰冻切片法、冰冻切片粘片法及冰冻包埋液（OCT compound）包埋切片法。
原理
冰冻切片是将组织进行冰冻至坚硬后切片的特殊切片，其基本原理是利用低温环境将组织样本迅速冷冻。被冷冻时，组织中的水变成冰而使组织变得坚硬，使细胞和组织结构保持较好的形态和抗原性，其硬度可通过改变温度加以调节。降温会使组织块更加坚硬，反之，提高温度则可使组织变软。大多数非脂肪不固定组织切片时最好控制在在-20~-25 ºC。切割时使用专门的切片机（冰冻切片机），可以得到薄至几微米的切片。
特点
步骤
常见问题与建议
应用示例
1. 免疫荧光染色确认LC-MM在动脉粥样硬化斑块中的靶向积累及对VCAM-1的依赖性
构建巨噬细胞膜（MM）伪装活性氧（ROS）敏感纳米治疗平台（LC-MM），以提高动脉粥样硬化（AS）靶诊断和治疗效果。
静脉注射LC-MM 2 h后，分离整个主动脉进行离体成像。LC-MM组主动脉内荧光（FL）信号明显高于LC（由草酰氯OC与洛伐他汀LVT和CDs进行酯化和酰胺化反应合成）组和碳基荧光纳米材料(碳点)CDs组。主动脉根部冰冻切片的免疫荧光染色分析进一步证实了血管细胞粘附蛋白1（VCAM-1）对AS斑块中LC-MM靶积累的关键作用。斑块区域横切面免疫荧光图像证实LC-MM在斑块病变处具有明显的渗透和滞留，具有非常高的FL强度，证实了LC-MM在斑块中的目标积聚，促进了FL的精确成像。
<静脉注射LC-MM 2 h后，载脂蛋白E缺乏（ApoE−/−）小鼠主动脉根部冷冻后VCAM-1免疫荧光染色的CLSM图像>[1]
2. 在空间转录组学（Spatial transcriptomics）中定位基因表达于组织中的空间位置
使用低温恒温器从新鲜冷冻的组织中获得薄组织切片。将一个组织切片连接并固定在微阵列载玻片上的每个子阵列上，然后对组织进行固定、染色和成像，确定每个区域相对于空间斑点的形态和空间位置。组织被渗透，以促进RNA从细胞中释放，并使RNA与表面探针杂交。进行反转录，在载玻片上直接生成cDNA。这是随后的酶消化和去除组织切片。将探针/cDNA片段从表面释放，在试管中收集。cDNA被扩增并转化为完成的成对端文库。对文库进行测序和进一步处理，将表达的基因定位到它们在组织中的表达空间位置。
<空间转录组学的部分工作流程>[2]
3. 刚果红（CR）染色评估心肌活检样本中淀粉样蛋白沉积的相对量
使用从患者身上获得的新鲜冷冻心内膜心肌活检（EMB）。每个冷冻活检标本的直径约为1~2 mm，制备10 μm厚的低温恒温器切片并放置在载玻片上。将切片在碱性刚果红CR溶液（CR 3 g/L、NaCl 3 g/L、80% 乙醇、0.01% NaOH）中孵育15 min，用水冲洗，在 Mayer 血（Merck，109249）中复染，用水冲洗，二甲苯脱水并封片。通过偏振光显微镜中的黄色到绿色双折射验证了CR阳性（红色）染色的特异性。随后使用Hamamatsu NanoZoomer S60全玻片扫描仪在常规明场照明下以60 倍放大倍率扫描样品，并使用 NDP.view2软件检查数字玻片确定淀粉样蛋白沉积量。通过目测估计心肌中 CR淀粉样蛋白沉积的相对量来对淀粉样蛋白沉积进行分级。
在明场显微镜下观察的CR染色切片（图A~D）。通过荧光显微镜和德克萨斯红滤光片（黄色）观察的CR染色切片（图E~H）。活检标本显示不同程度的淀粉样蛋白沉积（0=0%，+=<5%，++=5~20%，+++=>20%）。
<刚果红染色后对新鲜冰冻EMB标本中淀粉样蛋白含量进行分级>[3]
4. 免疫组织化学分析蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根组织中各个空间条形码体素的组织结构特征
将植物蒺藜苜蓿根组织快速冷冻以产生16 μm厚的冷冻切片，每个冷冻切片包含许多根横截面。冷冻切片固定到捕获区域，每个区域都配备了大约5000个分辨率为55 μm的空间条形码体素（图a）。明场组织图像和底层空间捕获体素的并排图像，捕获区域内单个根横截面的特写视图，突出了与组织相关的体素大小（图b）。
<捕获区域冰冻切片中蒺藜苜蓿根横截面的特写视图>[4]
5. 苏木精-伊红（H&E）染色鉴别基底细胞癌切片中表皮和真皮的组织特征
<H&E染色BCC切片的荧光寿命成像>[5]
总结
冰冻切片是一种组织学技术，通过快速冷冻组织样本并在低温下切割，以获得薄片用于显微镜观察。相较于常规的石蜡切片，这种方法制片快速操作简单，且在一定程度上保持了组织内的生物活性。通常用于病理学、组织学以及生物医学研究。
相关参考文献：
[1] Duan X, Yang X, Mou N, et al. Reactive Oxygen Species-Triggered Carbon Dots-Based Biomimetic Nanotheranostic Agents for Atherosclerosis Management[J]. Advanced Functional Materials, 2024, 2405629.
[2] Salmén F, Ståhl P L, Mollbrink A, et al. Barcoded solid-phase RNA capture for Spatial Transcriptomics profiling in mammalian tissue sections[J]. Nature Protocols, 2018, 13(11): 2501-2534.
[3] Noborn F, Thomsen C, Vorontsov E, et al. Subtyping of cardiac amyloidosis by mass spectrometry-based proteomics of endomyocardial biopsies[J]. Amyloid, 2023, 30(1): 96-108.
[4] Serrano K, Bezrutczyk M, Goudeau D, et al. Spatial co-transcriptomics reveals discrete stages of the arbuscular mycorrhizal symbiosis[J]. NatPlants, 2024, 10(4): 673-688.
[5] Luo T, Lu Y, Liu S, et al. Enhanced Visualization of Hematoxylin and Eosin Stained Pathological Characteristics by Phasor Approach[J]. Analytical Chemistry, 2017, 89(17): 9224-9231.
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