Nature、Science齐发！成功开发毛发皮肤类器官-巨噬细胞共培养模型并创建产前人类皮肤图谱

人类产前皮肤由包括巨噬细胞在内的先天免疫细胞构成，但目前尚不清楚这些细胞是否仅在免疫中发挥作用，还是在形态发生中具有其他功能。该研究结合单细胞和空间转录组学数据构建了一个全面的产前人类皮肤（妊娠后7-17周）多组学参考图谱，以表征皮肤的微观解剖组织龛。该图谱揭示了非免疫细胞和免疫细胞之间的相互作用是毛囊形成的基础，与无瘢痕伤口愈合有关，并对皮肤血管生成至关重要。此外，系统地比较了由人胚胎干细胞和诱导多能干细胞衍生的毛发皮肤类器官（SkO）模型与产前和成人皮肤。SkO模型再现了毛囊发育过程中体内皮肤表皮和真皮细胞类型以及与遗传性毛发和皮肤疾病发病机制有关的基因表达。然而，SkO模型缺乏免疫细胞，内皮细胞异质性和数量明显降低。我们的体内产前皮肤细胞图谱表明，巨噬细胞和巨噬细胞衍生的生长因子在驱动内皮细胞发育中起作用。事实上，将诱导多能干细胞衍生的自体巨噬细胞转移到SkO培养物中后，血管网络重构得到增强。因此，先天免疫细胞是皮肤形态发生的关键角色，而不是它们在免疫中的传统角色，它们通过与非免疫细胞的相互作用来实现这一功能。

产前毛囊（HFs）在妊娠后11至14周开始形成，由表皮基质（表皮层增厚的病灶）和真皮凝聚物（真皮成纤维细胞的聚集体）之间的相互作用启动，而皮脂腺在妊娠后16周左右开始发育。然而，关于这些发育时期人类产前皮肤的精确细胞组成以及细胞是否在支持皮肤形态发生的功能性微解剖壁龛中相互作用，目前缺乏相关研究。产前皮肤在无菌环境中与羊水接触。然而，免疫细胞如巨噬细胞早在妊娠后6周就在皮肤上生长，并表达一系列促炎基因，尽管与抗原呈递相关的基因（如主要组织相容性复合体II类（MHCII））在妊娠后11周后才上调。妊娠后11周前促炎基因与MHCI基因的表达解耦表明抗原呈递可能不是妊娠早期人类巨噬细胞的关键功能。再加上有证据表明巨噬细胞在小鼠模型中组织稳态和愈合中发挥作用，这就提出了巨噬细胞是否有助于人类早期皮肤形态发生的问题。

该研究提供了一个全面的7-17 PCW人类产前皮肤的多组学细胞图谱，使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学和多重RNA原位杂交分析了人类产前皮肤，以解码整个妊娠期调节皮肤和HFs形态发生的动态细胞和分子变化。此外，利用成人健康皮肤和HFs数据集来比较和评估促进无疤痕皮肤愈合的发育特异性特征和指导复发HFs形成的线索，并使用一个毛发SkO模型来验证巨噬细胞在产前皮肤血管网络形成中的作用。

1、人类产前皮肤单细胞图谱

该研究整合了新的和已发表的成人皮肤和由人类胚胎干细胞（ES）细胞和诱导多能干细胞（iPS）细胞衍生的毛发SkO模型的单细胞数据集进行比较分析。根据差异表达基因（DEGs）对细胞状态进行了广泛的细胞标记（表皮，真皮基质，免疫和内皮）和细粒度注释。先天免疫细胞，如巨噬细胞和先天淋巴样细胞（ILCs），在妊娠早期即出现，而B细胞和T细胞出现较晚，伴随胸腺、骨髓和脾脏的形成，大约在妊娠10周左右。使用非负矩阵分解（NMF）评估细胞类型共定位，并结合相关分析计算预测微环境。共定位可以通过共享微环境的两种或两种以上细胞类型的高比例和/或细胞对之间的正相关系数来表示。该研究分析预测了产前皮肤不同的微环境，包括表皮，真皮，血管和神经细胞，每一个包括特定类型的免疫细胞。巨噬细胞在“早期和晚期神经血管微环境”（分别为MEl和MES）中与内皮细胞和神经细胞共存，而根据相关性分析，真皮前凝集物（pre-Dc）与树突状细胞和淋巴样细胞共存。这些观察结果表明，免疫细胞可能在妊娠早期占据特定的微解剖壁龛，并具有非免疫功能。接下来，利用SkO模型整合并比较了人类产前和成人皮肤数据。目的是确定SkO模型在分子水平上再现人类皮肤分化的程度，以及其在功能上评估免疫细胞在皮肤形态发生中的作用的潜在效用。值得注意的是，SkO模型重现了产前皮肤HF的不同成分，滤泡间表皮，神经细胞和真皮成纤维细胞，但免疫细胞没有出现，内皮细胞明显减少（图1）。

图1

2、表皮平台和基质形成

产前8周的皮肤由一层表皮细胞覆盖在真皮基质上，11周的表皮脱落；在14-15 PCW时，观察到基底细胞（毛发平台和生殖细胞）出芽和HFs（发桩）伸长；在17 PCW时，分层表皮层下可见发夹。与组织学观察一致，scRNA-seq数据中从14个PCW中鉴定了HF细胞，包括基板、基质（SHH+）、外根鞘（ORS） （SLC26A7+）、伴生层（CL）、内根鞘（IRS）以及角质层和皮层细胞(角质层/皮层；HF内层的一部分)。此外，还观察了未成熟和成熟的滤泡间表皮细胞（IFE）。未成熟的IFE细胞。在从胚胎皮肤向胎儿皮肤过渡的过程中，从7 PCW开始出现未成熟的IFE细胞，包括表皮周细胞、未成熟的基底细胞和未成熟的基底上细胞，在11 PCW后减少。成熟的基底细胞（DPYSL2+）和基底上IFE细胞在11PCW后增加，而POSTN+基底细胞在整个妊娠期间都存在。RNAscope（FOXP3+）和免疫荧光染色（FOXP3+）显示，早在15 PCW时，Tre细胞主要位于HFs内部和周围，而不是毛囊间皮肤（图2）。

图2

3、HF的间质分化

为了推断Dc前细胞的起源以及Dc和Dp，该研究对产前皮肤和SkO成纤维细胞簇进行了轨迹和伪时间分析。轨迹分析预测HOXC5+早期成纤维细胞（位于真皮上层，在11 PCW前丰富）沿两条路径分化：第一条（毛发成纤维细胞轨迹）形成毛发特化成纤维细胞（Dc前细胞，Dc和Dp），第二条（真皮成纤维细胞轨迹）形成WNI2+成纤维细胞和PEARI+成纤维细胞（11 PCW后丰富）。该研究探索了指导早期HF形成的间充质-上皮相互作用。受体配体分析预测了pre-Dc细胞表达的CXCL12与表皮基底细胞上的ACKR3之间的相互作用。RNAscope分析证实这两个基因共定位。这一结果表明CXCL12可能与ACKR3相互作用介导pre-Dc细胞的迁移。Dc表达FAM3C和EFNB1，并分别与LAMPI、CXADR和EPHB6相互作用，促进细胞迁移和侵袭。最后，来自Dp的RSPO3被预测与上覆基质细胞中的LGR4和LGR6相互作用从而促进HF上皮细胞的增殖。值得注意的是，在HF形成的相应阶段，SkO模型的间质细胞和上皮细胞之间的相互作用是保守的。这些结果为我们的研究结果提供了正交验证，并加强了SkO作为产前皮肤发育精确模型的效用。还观察到假时间内大量匹配的TFs，这表明在HF成纤维细胞分化过程中，产前皮肤和SkO之间有相似的激活基因调节程序（图2）。

4、无疤痕愈合和潜在的巨噬细胞贡献

首先比较了产前皮肤真皮成纤维细胞和健康成人皮肤成纤维细胞。所有成年成纤维细胞亚群都表达高水平的炎症细胞因子和受体（如IL6和ILIRA）以及参与抗原呈递（如HLA-A）、先天免疫和炎症反应（如CD55和PTGES）和细胞衰老（CDKNIA）的基因。相比之下，产前皮肤成纤维细胞具有上调的参与免疫抑制（CD200）、炎症调节（如RAMP2）和组织再生（MDK）的基因。成人成纤维细胞的基因表达谱在WNT2和PEARI产前成纤维细胞中增加，在妊娠晚期大量表达。晚期妊娠WNI2成纤维细胞调节与细胞外基质和胶原沉积相关的基因（例如COLIAI），而早期妊娠WNI2+成纤维细胞有参与细胞生长和分化的DEGs（例如SFRPI）。值得注意的是，WNI2和PEARI产前成纤维细胞表达了与细胞衰老（CDKNIA）、细胞因子途径（如ILIRI）和胶原沉积（如POSIN）相关的几个基因，这些基因在纤维化皮肤疾病的致病性成纤维细胞中高表达。这些结果进一步支持我们的发现，即瘢痕促进基因在妊娠晚期逐渐获得，这与妊娠晚期皮肤瘢痕形成的临床观察一致。具体而言，LYVEI巨噬细胞与WNI2成纤维细胞共定位，并且预测它们通过成纤维细胞上表达的血小板源性生长因子（PDGFs）和相应受体（PDGFRa和PDGFRβ）相互作用。产前皮肤TREM2的小胶质细胞样（TML）巨噬细胞与胚胎脑小胶质细胞高度相关，并共表达免疫调节基因，包括免疫抑制受体（如CX3CR1）和IL-6产生的调节因子（如SYTII）。在小鼠皮肤移植和胎儿伤口中，炎症和IL-6的下调赋予抗纤维化特性TML巨噬细胞被预测在产前皮肤（6-8 PCW）与WNI2的成纤维细胞共定位，与成人成纤维细胞相比，WNI2+成纤维细胞的IL6表达下调。这使我们推断巨噬细胞在产前皮肤无瘢痕愈合中有潜在的作用（图3）。

图3

5、巨噬细胞在皮肤神经分化中的作用

TML巨噬细胞还被预测在产前皮肤中与Schwann细胞（早期神经血管微环境）共定位，并表达与细胞迁移和神经发育相关的基因，这反映了小鼠皮肤中大脑小胶质细胞和周围神经相关巨噬细胞的功能（图1、3）。这些发现表明，如之前在小鼠皮肤中报道的那样，产前皮肤巨噬细胞可能支持妊娠早期皮肤周围神经系统的建立。

6、巨噬细胞支持产前皮肤血管生成

多重RNAscope和免疫荧光染色显示LYVEI'和TML巨噬细胞靠近内皮细胞。该研究观察到免疫缺陷的SkOs与产前皮肤相比，内皮细胞的异质性越来越少，尽管形成了发育良好的HFs，表皮和神经细胞。推断轨迹分析显示，产前皮肤的早期内皮细胞分化为微动脉通路（毛细血管、毛细血管和微动脉）或微静脉通路（毛细血管后小静脉和小静脉），并表达特征性基因（如GJAS用于微动脉，plvapar用于微静脉）。与SkO毛细血管细胞不同，产前皮肤毛细血管细胞可进一步分化为小动脉。这些发现表明，SkO中的高VEGF生成不能弥补驱动GATA2活性和下游VEGF受体表达的巨噬细胞相关因子的缺失。即使在培养5周后，巨噬细胞仍与血管共定位。与不含巨噬细胞的对照SkOs相比，与巨噬细胞共培养的SkOs形成了更精细、更有组织的血管网络。与巨噬细胞共培养的SkOs中未见上述现象，而与对照SkOs共培养的SkOs中内皮细胞密度较高，呈网状聚集。这种无序的血管网可能妨碍了分离内皮细胞进行scRNA-seq分析。综上所述，我们的研究结果表明，巨噬细胞和内皮细胞之间的相互作用是通过血管重塑支持血管生成所必需的（图4）。

图4

该研究的产前人类皮肤图谱是探索导致先天性毛发和皮肤疾病的基因的宝贵资源。该研究发现，相关基因确实在产前皮肤发育和HF分化期间表达，因此支持这些疾病的子宫内起源。系统的产前皮肤SkO比较提供了一个蓝图，以指导更可靠的体外SkO生成，这有助于未来的研究与微生物群的相互作用，先天性皮肤疾病的发病机制，以及毛发和皮肤工程的治疗应用，包括毛发再生和皮肤移植。

参考文献

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