【Abstract】
2024年10月，首尔国立大学化学与生物工程学院Byung‐Soo Kim教授团队在期刊【Nature Communication】上发表题为“Spatiotemporal control of neutrophil fate to tune inflammation and repair for myocardial infarction therapy”的研究论文。
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【Background】
1. 心肌梗死（MI）是全球主要的致死性疾病之一。其致病机理包括：当心肌受损时，细胞释放损伤分子（DAMPs），吸引中性粒细胞到达损伤部位。被激活的中性粒细胞产生活性氧（ROS），释放促炎性物质、蛋白酶和捕获网（NETs），加剧心肌细胞死亡和组织损伤。过度活化的中性粒细胞还会抑制巨噬细胞由M1向M2的修复性极化，延长炎症，最终导致心肌纤维化和心功能衰退。
2. 目前常通过药物或抗体耗竭中性粒细胞来减少炎症，但效果不理想。原因包括：中性粒细胞与其他免疫细胞相似，缺乏特异性靶标，可能引发副作用。
3. 本研究设计了一种纳米颗粒：他可以只在高ROS环境下释放药物，诱导中性粒细胞凋亡，防止过度炎症。减少对未活化细胞和其他免疫细胞（无高浓度ROS）的影响，降低副作用。另外，凋亡的中性粒细胞被巨噬细胞清除（凋亡细胞清除），促使其向M2型极化。
【Material System】
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒，负载环素依赖性激酶抑制剂Roscovitine和酶Catalase。
1. PLGA：作为纳米颗粒的载体，PLGA具有良好的生物相容性和可降解性。
2. Catalase：能够分解活性氧（ROS），尤其是过氧化氢（H₂O₂），生成氧气。这一反应导致纳米颗粒内部压力升高，进而引发纳米颗粒的结构变化或解体。因此实现纳米颗粒在高ROS环境下释放Roscovitine，确保药物只在活化的中性粒细胞中释放。
3. Roscovitine：通过抑制中性粒细胞的环素依赖性激酶活性，诱导中性粒细胞的凋亡，减少炎症反应并防止进一步的组织损伤。
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【Material Function】
1. 靶向性：RC NPs被中性粒细胞吸收，随其迁移至心梗部位。活化的中性粒细胞产生H₂O₂，触发Catalase反应生成氧气，使纳米颗粒解体并释放Roscovitine。
2. 促中性粒细胞凋亡：Roscovitine释放后诱导中性粒细胞凋亡，减少炎症反应，抑制NETs形成，降低TNF-α等促炎因子的释放。
3. 促进巨噬细胞极化：凋亡的中性粒细胞被巨噬细胞清除，促使其向M2型极化，修复心脏组织。RC NPs在减少纤维化、促进心肌和血管生成方面优于传统疗法，并显著改善心脏功能。
【Result ＆ Figure】
一、H2O2响应性 RC NP 的设计和表征
1. RC NPs的物理化学性质：RC NPs的粒径为429.7±72.8nm，PDI为0.058，Zeta电位为-25.5±4.9mV（图2a），通过水-油-水的双乳化法制备，形成均匀的胶囊结构（图2b），并在PBS和血清中稳定7天（图2c）。 2. 药物释放性能：RC NPs在H2O2条件下更快释放Roscovitine（图2f），原因是催化酶作用以及形态变化（图2g）。 3. NPs与中性粒细胞的相互作用：90%以上的中性粒细胞在1小时内摄取RC NPs，摄取通过共聚焦显微镜验证（图2h）。摄取后中性粒细胞的迁移能力没有受影响（图2i）。 4. NPs对中性粒细胞的激活影响：RC NPs没有引发中性粒细胞异常激活或诱导NETs生成，SYTOX Green染色结果与PBS处理组相似（图2j）。 5. 药物毒性评估：含有20μM Roscovitine的RC NPs在6小时后保持90%以上的细胞存活率，显著高于游离药物（图2k）。![]()
Figure 2.RC NP 的表征。
二、RC NPs 在体外调节中性粒细胞命运
1. H2O2促发药物释放与凋亡：活化的中性粒细胞通过产生H2O2，内部化的RC NPs能够利用H2O2触发Roscovitine释放，从而诱导中性粒细胞凋亡，减少TNF-α、pro-MMP-9和中性粒细胞弹性蛋白酶的分泌（图3a）。 2. 凋亡评估：TUNEL实验显示，RC NPs处理的PMA激活的中性粒细胞凋亡显著增加，而不含催化酶或Roscovitine的NPs（R NPs和C NPs）没有显著诱导凋亡效果（图3b）。 3. 凋亡与NETosis的关系：RC NPs、Free R和Free RC均能增加中性粒细胞凋亡，并抑制NETosis（图3c）。C NPs虽然减少了NETosis，但未能引导凋亡。 4. 炎性因子抑制：RC NPs通过诱导中性粒细胞凋亡，显著减少PMA激活的中性粒细胞中TNF-α、pro-MMP-9和弹性蛋白酶的分泌（图3d-f）。![]()
Figure 3.体外 RC NP 介导的中性粒细胞命运调节。
三、凋亡中性粒细胞促进巨噬细胞极化
1. 促进中性粒细胞凋亡和巨噬细胞摄取：RC NPs处理的PMA激活中性粒细胞被巨噬细胞摄取（吞噬凋亡细胞）显著增加，流式细胞术和共聚焦显微镜结果验证了这一现象（图4a、4b）。 2. 巨噬细胞抗炎反应：吞噬RC NPs处理的中性粒细胞的巨噬细胞表现出抗炎修复表型，CD80和CD86的表达明显减少（图4c、4d）。此外，iNOS和Nos2的mRNA及蛋白表达下降（图4e、4f），TNF-α、IL-12 p40和IL-6的分泌显著减少（图4g、4h、4i）。 3. 修复型巨噬细胞的促进：RC NPs组的巨噬细胞中Mertk mRNA、TGF-β1分泌和CD206蛋白表达显著增加（图4j、4k、4l），显示了RC NPs通过增强中性粒细胞凋亡促进巨噬细胞向修复型表型转化。![]()
Figure 4.RC NP +凋亡中性粒细胞的巨噬细胞胞吞作用和极化。
四、RC NP 体内的生物分布
1. RC NPs在中性粒细胞中的高摄取：静脉注射RC NPs后，BALB/c小鼠的中性粒细胞摄取率在10分钟和30分钟时超过55%，并且始终高于单核细胞（图5a, 补充图6a）。30分钟后，循环中的RC NP+细胞中有47%以上是中性粒细胞（图5b, 补充图6b, 7）。 2. 药物在体内的短半衰期：24小时和72小时后，RC NP+中性粒细胞和单核细胞的比例显著下降，归因于它们在体内的短半衰期。RC NPs的荧光信号也在24小时内急剧下降，并持续减少到72小时（图5c）。 3. 心脏中的药物积累：MI（心肌梗死）大鼠的心脏中RC NPs积累水平是对照组（假手术）大鼠的3倍，同时RC NPs也在肝脏、脾脏和肺部积累（图5d, 5e）。 4. 心脏中的细胞组成差异：流式细胞术显示，MI大鼠心脏中的RC NP+细胞中有35.1%是中性粒细胞，而假手术组只有5.4%（图5f, 补充图8）。此外，MI大鼠心脏中13.4%的RC NP+细胞是单核细胞，而假手术组为7.7%。![]()
Figure 5.RC NP 的生物分布。
五、RC NPs 调节 MI 后免疫细胞动态
1. RC NPs诱导中性粒细胞凋亡：MI后24小时，RC NPs显著增加了心脏中TUNEL+（凋亡标志物）中性粒细胞的比例，并减少了CitH3+（NETosis标志物）中性粒细胞的比例，表明RC NPs将中性粒细胞从NETosis引导至凋亡（图6a, 6b）。 2. 巨噬细胞表型转变：RC NPs治疗使心脏中iNOS+（M1型标志物）巨噬细胞比例减少，而CD206+和Arg1+（M2型标志物）巨噬细胞比例增加（图6c, 6d）。流式细胞术还显示，RC NPs显著降低了M1型巨噬细胞（CD80+、CD86+）的比例（图6e）。 3. 长期效果：MI后5天，RC NPs处理的心脏中M1型巨噬细胞和中性粒细胞数量显著减少，而总白细胞、巨噬细胞和T细胞的数量未发生显著变化（补充图11a–e）。 4. NETs和中性粒细胞颗粒蛋白的降低：RC NPs治疗使MI大鼠血清中与NETs相关的蛋白S100A9和中性粒细胞颗粒蛋白LL-37水平降低（图6f, 6g）。![]()
Figure 6.MI 后 RC NP 介导的免疫细胞动力学调节。
六、RC NP 可以保护 MI 后的心脏功能
1. 减少心脏纤维化和保护心肌：RC NPs处理显著减少心脏纤维化面积，同时保护了心肌组织（图7b）。TUNEL分析显示，RC NPs通过调节中性粒细胞凋亡，显著减少了中性粒细胞介导的心肌细胞和心内皮细胞死亡（图7c, d）。 2. 增强心肌细胞和内皮细胞存活：RC NPs治疗在MI后4周内显著增加了心肌cTnT+面积和CD31+内皮细胞密度（图7e, f）。 3. 改善心脏功能：超声心动图显示，RC NPs治疗后射血分数和缩短分数在MI后1周内显著保留（图8c, d），同时左心室内径和心脏壁厚度等参数也得到了保护（图8e–g）。PV环显示，RC NPs治疗显著提高了心脏输出量和每搏量（图8i, j），改善了心脏收缩和舒张功能（图8k–n），并减少了心脏重构（图8o）。 4. 相比Free R组的优势：尽管Free R治疗在减少纤维化、增加心肌面积和改善心脏功能方面具有一定疗效，但RC NPs通过优先诱导活化的中性粒细胞凋亡，表现出更高的治疗效果，且有助于巨噬细胞的重编程（图6）。![]()
Figure 7.RC NP 可减轻 MI 后的不良重塑。
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Figure 8.MI 后 RC NP 介导的心脏功能保存。
七、多形核细胞耗竭降低了 RC NP 的功效
1. 中性粒细胞去除实验：使用抗PMN抗血清去除中性粒细胞，RC NP组与中性粒细胞去除的RC NP组进行了对比。通过超声心动图评估心脏功能（图9a, 9b）。
2. 射血分数和缩短分数的变化：RC NP处理的射血分数和缩短分数显著高于去除中性粒细胞的RC NP组（图9c, 9d）。表明中性粒细胞在RC NP治疗效果中起到了重要作用。
3. LVIDs的差异：虽然RC NP组和去除中性粒细胞的RC NP组在LVIDs（左心室收缩末内径）上差异不显著，但RC NP组的LVIDs在MI后4周内显著低于PBS组，而中性粒细胞去除的RC NP组只在MI后一周内显著低于PBS组（图9e）。
4. LVIDd的变化：RC NP组和去除中性粒细胞的RC NP组在LVIDd（左心室舒张末内径）上无显著差异（图9f）。
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Figure 9.多形核细胞耗尽后 RC NP 的功效降低。
八、RC NP 的生物相容性
1. 对循环中性粒细胞的影响：RC NPs未影响MI后循环中的中性粒细胞水平（图10a, 补充图14a, b），表明RC NPs不会引起全身性中性粒细胞减少，避免了可能导致的中性粒细胞减少症和感染风险。 2. 心脏中性粒细胞减少：MI后第3天，RC NPs显著减少了心脏中的中性粒细胞数量，可能与其心脏保护作用有关（图10b）。 3. 对其他器官的长期影响：RC NPs主要积累于肝脏和脾脏，但未引发明显的细胞周期停滞或凋亡，且未显著改变凋亡调控蛋白Bax、Bcl2和Bclxl的mRNA表达（图10c, 10d, 补充图15）。组织学分析也显示RC NPs未在主要器官中引起可见的毒性（图10e）。 4. 血液化学指标和LDH水平：除显著降低了MI后第3天的血清乳酸脱氢酶（LDH）水平（表明组织损伤减少）外，RC NPs对血液化学指标无显著影响（补充图14, 16）。![]()
Figure 10.RC NP 的毒性评估。
【Reference】
Kim C, Kim H, Sim WS, et al. Spatiotemporal control of neutrophil fate to tune inflammation and repair for myocardial infarction therapy. Nat Commun. 2024;15(1):8481. Published 2024 Oct 1. doi:10.1038/s41467-024-52812-6
