创伤精准修复公众号是创伤精准修复课题组（W&H Group）的官方公众号。本课题组以创伤精准修复与临床转化为主要研究方向。
公众号推出的每一篇文章均是由W&H Group成员精选精读，旨在分享传播与创伤修复相关的最新科研成果。
知识点1 — 特异性氢氧根离子（·OH）捕获剂
氢氧根离子捕获剂是指那些能够高效且选择性地捕获·OH的材料。这类捕获剂在化学分离、催化、环境治理等领域有着广泛的应用。本文以5,5二甲基-1-吡咯啉N-氧化物（DMPO）作为特异性·OH捕集剂。DMPO是一种高效的自由基捕获剂，广泛应用于电子顺磁共振（EPR）技术中检测·OH等活性氧物种（ROS）。DMPO与自由基反应形成稳定的加合物，可藉此分析自由基的产生和反应机制。它对光敏感且易吸湿，需在-20℃下储存，应避免直接接触。DMPO在化学、生物医学研究中至关重要，用于研究自由基反应、氧化应激和相关疾病。
知识点2 — 动态流变分析
流变仪进行的动态流变分析是一种测量材料在周期性应力或应变下的弹性和粘性特性的技术。使用流变仪，可以评估材料的储能模量（G'）和损耗模量（G''），这些参数反映了材料的刚性和能量耗散能力。
知识点3 — 180°剥离粘附试验
180°剥离粘附试验是一种用于评估材料表面粘附性能的测试方法。这种试验通常用于测量涂层、薄膜、胶带或其他粘附材料与基材之间的粘附强度。
基本原理和步骤等：
1. 原理：试验中，粘附材料的一端固定，然后以180°的角度逐渐剥离，直到完全剥离。通过测量剥离过程中所需的力，可以评估粘附材料与基材之间的粘附强度。
2. 步骤：准备样品，将粘附材料粘贴在基材上。固定粘附材料的一端。以恒定的速度进行剥离。使用剥离试验机测量剥离过程中的力。
3. 设备：通常使用专门的剥离试验机进行测试。
4. 结果分析：测试结果通常以力位移曲线表示。曲线的斜率反映了粘附强度。曲线下的面积可以提供粘附能的量化评估。
5. 标准：180°剥离试验通常遵循特定的标准，如ASTM D3330等。
DOI：10.1002/adma.202312440
（A）抗氧化活性收缩水凝胶（AHF@AS Gel）的制备示意图。（B）AHF@AS凝胶促进伤口愈合机制示意图。AHF@AS研究了凝胶通过减少多余的ROS和机械收缩力来减轻过度激活的炎症和促进增殖。因此，AHF@AS凝胶促进皮肤再上皮化和收缩，同时调节生化和机械敏感信号，加速伤口愈合。
（A）通过脂多糖（LPS）刺激小鼠源性巨噬细胞（RAW264.7）的炎症模型揭示了AHF的抗炎潜在机制。（B、C）使用Western blot（WB）分析量化促炎M1型巨噬细胞的代表性标记物的蛋白表达，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、T淋巴细胞活化抗原CD86（CD86）和肿瘤坏死因子（TNF-α）。在LPS处理24小时后，与对照组相比，这些标记物的蛋白表达显著增加，表明通过LPS共孵育成功诱导了促炎M1型巨噬细胞。（D）利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术（FCM）评估了AHF对促炎M1巨噬细胞细胞内ROS的影响。2’-7’-二氯二氢荧光素（DCF）的荧光强度在LPS刺激下通过CLSM得到了极大的增强。（E、F）用流式细胞术定量检测AHF处理后促炎M1型巨噬细胞中的ROS水平。LPS孵育巨噬细胞后，ROS水平明显升高。值得注意的是，AHF显著降低M1型巨噬细胞的ROS水平。这些结果表明AHF可以有效调节促炎M1型巨噬细胞的氧化还原稳态，从而减轻炎症。（G）透射电镜图像显示，M1型巨噬细胞线粒体出现膜破裂、基质丢失、嵴紊乱、内部空泡。相反，与AHF共培养后，巨噬细胞线粒体结构的完整性明显改善。
（A）检测了AHF在体外增殖过程中对细胞凋亡的抑制作用和促进迁移的作用。构建过氧化氢（H2O2）诱导的角质形成细胞（HEK-a）氧化损伤模型。（B、C）评价AHF对HEK-a细胞凋亡的保护作用和伤口再上皮化能力的恢复作用。通过流式细胞术分析H2O2和AHF共培养3 h后HEK-a细胞的凋亡情况，测定凋亡细胞比例。与H2O2模型组（8.67% ± 0.96%）相比，AHF处理组的凋亡细胞比例明显降低，为2.91% ± 0.38%。（D）使用CCK-8测定法评估了AHF处理后氧化损伤的HEK-a细胞的细胞活力。结果显示，经过AHF处理后，细胞活力显著提高约20%，表明AHF可以有效保护细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。（E-G）测量了H2O2刺激后HEK-a细胞内ROS水平。在H2O2的作用下，CLSM和FCM在HEK-a细胞中表现出较高的DCF荧光信号。在H2O2诱导的HEK-a细胞氧化损伤后，AHF减少了过量的细胞内ROS，并将其恢复到正常水平。（H）200 μm H2O2处理5 h后，L929细胞的迁移能力逐渐下降，再处理10 h后，细胞的迁移能力明显受到抑制。（I）与H2O2和AHF共培养5 h后，L929细胞的迁移抑制减轻。AHF处理10 h后，细胞迁移能力较H2O2处理组提高了约25%，表明AHF即使在高氧化应激条件下也能促进细胞迁移。
（A）ICR小鼠全层创面模型（Φ：5 mm）治疗过程。将创面小鼠随机分为四组：生理盐水（对照组）、AS凝胶、低浓度AHF@AS凝胶（L-AHF@AS Gel，2 mg mL−1 AHF）、高浓度AHF@AS凝胶（H-AHF@AS Gel，4 mg mL−1 AHF）。（B、C）在第0、5、9天进行宏观观察。图像显示，三个治疗组（AS凝胶，LAHF@AS凝胶和H-AHF@AS凝胶的小鼠伤口愈合速度比对照组快。（D）在第9天，与对照组相比，单独使用AS凝胶可使伤口愈合速度加快13.00%。此外，H-AHF@AS凝胶处理组小鼠的闭合率优于L-AHF@AS凝胶处理组。特别地，H-AHF@AS凝胶处理组小鼠的闭合率最高，为≈60%，而对照组仅为≈23%。（E-G）通过H&E和Masson染色来评估AHF@AS凝胶对急性伤口愈合的影响。与对照组相比，AS凝胶、LAHF@AS凝胶和H-AHF@AS凝胶处理小鼠皮肤的再上皮化和厚度均显著增强。其中，H-AHF@AS凝胶诱导的再上皮化水平最高。但H-AHF@AS凝胶组皮肤厚度低于其他凝胶处理组，说明H-AHF@AS凝胶组大量增生性肉芽组织逐渐转化为成熟胶原沉积。此外，对照组的伤口显示少量肉芽组织增生，但有相当多的炎症细胞浸润。用AS凝胶、LAHF@AS凝胶和H-AHF@AS凝胶治疗9天后，创面炎症细胞浸润减少，成纤维细胞增多，表明愈合进入增殖期。H-AHF@AS凝胶处理后，几乎没有炎症细胞浸润，但观察到丰富的成纤维细胞。（H）Masson染色定量测定胶原沉积。与其他处理相比，H-AHF@AS凝胶处理的伤口也显示出明显更高的胶原沉积。上述结果表明，AHF@AS凝胶可明显减轻组织炎症，促进上皮细胞生长，促进胶原沉积，加速急性伤口愈合。
（A）db/db糖尿病小鼠全层创面模型（Φ：5 mm）治疗过程。（B-D）第4、8、11、14天创面的照片、创面闭合轨迹及相应的定量闭合率。宏观上看，由于AS凝胶治疗组具有良好的主动机械收缩性能，观察结束时伤口愈合明显加快。（E）为了确认愈合过程，在第14天处理伤口样本，使用H&E和Masson染色进行进一步调查。H&E染色显示，对照组肉芽组织增生极少，并伴有大量炎性细胞浸润。棕色箭头：炎性细胞；蓝色箭头：成纤维细胞；绿箭头表示血管。（F）AS凝胶和AHF@AS凝胶治疗14天后，创面附近炎症细胞浸润明显减少，成纤维细胞丰富，新生血管增多。AS凝胶和AHF@AS凝胶均能显著促进再上皮化，后者效果更佳。（G）AS凝胶和AHF@AS凝胶治疗明显减少了伤口的宽度，尤其是AHF@AS凝胶。（H）与ICR小鼠急性伤口愈合的观察结果相似，治疗组的皮肤厚度高于对照组。但AHF@AS凝胶组皮肤厚度低于AS凝胶组。（E、I）Masson染色显示，AS凝胶和AHF@AS凝胶处理的伤口胶原沉积明显高于对照组，尤其是AHF@AS凝胶。（J）动物实验结束时对AS凝胶和AHF@AS凝胶的生物安全性进行了评价。用AS凝胶或AHF@AS凝胶治疗14天后，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等主要脏器进行H&E染色。病理结果显示，主要脏器组织结构未见异常变化。上述结果表明，AS凝胶和AHF@AS凝胶均能显著促进慢性糖尿病创面愈合，且无明显毒性。
（A）蛋白质组学的流程工作示意图。（B）在db/db小鼠创面组织中，AS Gel组与对照组相比有827个差异蛋白，AHF@AS Gel组与对照组相比有1359个差异蛋白，AHF@AS Gel组与AS Gel组相比有490个差异蛋白，两组之间有678个差异蛋白。（C）生物过程（BP）分析表明，这些差异蛋白主要参与免疫应答、细胞增殖和迁移、血管生成、胶原蛋白和细胞外基质组织的正向调节。（D）根据伤口愈合过程，在热图中将初级差异蛋白分为三类：炎症期、增殖期和重塑期。（E）为了确定关键的差异蛋白，使用STRING数据库分析蛋白-蛋白相互作用（PPI）。发现与增殖和重塑期相关的差异蛋白在处理14天后有更多的连接线。具体来说，在增殖期，各种血管生成相关的差异蛋白，包括J型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（Ptprj）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶26（mst4）、程序性细胞死亡蛋白10（Pdcd10）、CD63、腱蛋白n（Tnn），以及细胞迁移相关蛋白的表达，如尿激酶型纤溶酶原激活剂（Plau）、7-less同源物1（Sos1）和成纤维细胞生长因子1（Fgf1），都是高度相互关联的。
（A）通过免疫染色检测AHF@AS凝胶对巨噬细胞极化的影响。（B）研究结果显示，与对照组相比，AHF@AS水凝胶组中M1型巨噬细胞标记物CD86的荧光强度显著降低（比对照组低80%）。（C）此外，经过AHF@AS水凝胶处理后，M2型巨噬细胞标记物CD206的荧光强度明显增加（比对照组高8.4倍）。然而，单独使用AS水凝胶处理并没有显著改变CD86和CD206的表达。这些结果表明，AHF@AS水凝胶的治疗可以促进糖尿病伤口从炎症阶段向增殖阶段的转变，并且AHF在调节慢性糖尿病伤口闭合的炎症阶段中发挥了决定性作用。（D）使用血小板内皮细胞粘附分子-1 （CD31）免疫荧光染色观察增殖期新生血管的形成。As凝胶和AHF@AS凝胶处理后CD31的荧光强度均显著高于对照组。（E）具体来说，定量分析表明，AS凝胶组和AHF@AS凝胶组的CD31相对表达量分别高出3.6倍和6.1倍。（F、G）利用WB分析确定AHF@AS凝胶对增殖期关键蛋白表达的影响。表皮生长因子受体（EGFR）信号通路在细胞增殖、血管生成和细胞凋亡抑制中发挥重要作用。观察到，AS凝胶和AHF@AS凝胶处理后，EGFR的蛋白表达显著上调。其高表达会诱导下游双特异性丝裂原活化蛋白激酶1/2 （MEK1/2）表达增强，进而促进细胞增殖信号胞外信号调节激酶1和2 （ERK1/2）的表达，从而介导细胞增殖。因此，进一步检测了磷酸化细胞外ERK1/2（p-ERK1/2）的表达水平。不幸的是，治疗后p-ERK1/2蛋白表达没有明显变化。AS凝胶和AHF@AS凝胶均增强了磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表达。这表明AS凝胶和AHF@AS凝胶通过调节EGFR/Akt通路促进糖尿病创面愈合。此外，Akt通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR（mTOR）的磷酸化调节缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)和血管内皮生长因子A（VEGF-A）的表达，促进血管生成。AHF@AS凝胶处理后HIF-1、VEGF-A的蛋白表达明显增加，而AS凝胶的蛋白表达无明显变化。（H）AHF的引入使AHF@AS凝胶具有促进血管生成和抗细胞凋亡的优异性能，进一步提高了糖尿病创面的愈合效果。（I）为了评估AHF@AS凝胶处理后胶原的沉积和重塑，对胶原α-1（I）链（COL 1）和胶原α-1（III）链（COL 3）进行免疫荧光染色。治疗组胶原沉积较多，而对照组仅有少量胶原沉积。（J、K）AHF@AS凝胶组COL1和COL3的表达量分别比对照组增加了1.94倍和2.62倍。
综上所述，在这项研究中构建了一种新型的抗氧化活性收缩水凝胶（AHF@AS Gel），用于促进急性和糖尿病慢性伤口的愈合。研究团队通过实验发现，与传统治疗相比，AHF@AS Gel能够显著提高伤口的重新上皮化和皮肤收缩能力，从而加速伤口闭合。该水凝胶由氨基和羟基修饰的C70富勒烯（AHF）和热敏性活性收缩水凝胶（AS Gel）组成，通过减少过量的活性氧（ROS）发挥其治疗作用。
在实验中，AHF@AS Gel显著降低了M1型巨噬细胞标记物CD86的表达，并增加了M2型巨噬细胞标记物CD206的表达，表明其在调节炎症反应中起着关键作用。此外，与单独使用AS Gel相比，AHF@AS Gel在体内促进了从炎症阶段到增殖阶段的转变，有效促进了糖尿病慢性伤口的愈合。研究结果揭示了AHF@AS Gel通过调节炎症和增殖阶段，以及通过机械和生化信号的整合促进伤口闭合的潜力，为糖尿病慢性伤口治疗提供了新的策略。
1
欢迎加入交流群
欢迎加入学生QQ群：群号码565261531（或长按下方二维码）。
QQ交流群
2
同行微信群
申请入群请先添加审核微信ZMH-Manphie（或长按下方二维码），并请注明：创伤修复+姓名+单位+职称（或学位）+领域（或行业）。
审核微信
