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二乙酸荧光素（FDA）是一种非荧光物质，需要被细胞内的酯酶水解成荧光素后才能发出荧光；最大激发波长为488 nm，发射波长为530 nm；钙黄绿素AM（Calcein AM）是一种钙依赖型荧光分子，需要被细胞内的酯酶水解成钙黄绿素后才能发出荧光；最大激发波长为496 nm，发射波长为520 nm。
二者均具有细胞膜渗透性，能自由进入细胞，适用于活细胞成像；常用于检测细胞内酯酶的活性；可用于流式细胞术、荧光显微镜成像等。
1. 应激法：通过各种强烈的伤害性刺激（如强迫制动、饥饿和寒冷等），引起动物发生应激性溃疡。在众多应激性溃疡动物实验研究中，束缚浸水（Restraint water-immersion stress，RWIS）模型应用最为广泛。其特点是溃疡程度与浸泡水温的高低和时间长短有关。
2. 药物法：给动物注射或服用一定量的组织胺、胃泌素、肾上腺类固醇、水杨酸盐、血清素、利血平、保泰松等可造成动物胃肠溃疡。3. 乙醇法：乙醇引起胃溃疡的机制主要为损伤因子增多与防御因子减弱，其有多种途径诱导：自由基产生增多；胃黏膜脂质过氧化物产生增多；激活胃肠道的肥大细胞使其释放组胺、血小板活性因子、内皮素、白三烯及各种超氧化物；增加胃酸分泌和五肽胃泌素峰值；胃黏膜屏障受损；黏膜巯基物质含量减少；胃黏膜微循环障碍；胃黏膜疏水性及表面活性磷脂含量降低。4. 醋酸法：醋酸诱导大鼠胃溃疡模型方法可靠，重复性好，溃疡明显，与人类的慢性胃溃疡极为相似，在筛选治疗慢性溃疡药物、观察药物治疗效果方面应用广泛，是实验研究中较常用的造模方法。5. 幽门结扎法：幽门结扎后，可刺激胃液分泌并使高酸度胃液在胃中潴留，造成胃溃疡。这类溃疡复制方法简单，发生快，成功率高。6. 其他：①腺胃烧灼法，②幽门螺杆菌（HP）感染法。1. Ki-67（也称为MKI67和TSG126）是一个350-370 kDa的核蛋白，属于一个由有丝分裂染色体相关蛋白组成的分子组。Ki67最初被认为是与抗霍奇金淋巴瘤核物质的单克隆抗体Ki67相关的抗原。可以在细胞周期中不处于G0阶段的所有细胞中发现。因此Ki67可以作为细胞增殖标记物。
2. 增殖细胞核抗原（PCNA）是一种分子量为36 kDa的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反应细胞增殖状态的良好指标。且多项研究表明，评估不同来源肿瘤中的细胞增殖时，Ki-67的敏感性和特异性更高。
3. 微小染色体维持蛋白（MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7）六聚体是较早被发现的MCM蛋白功能复合体。复合体中MCM蛋白的特殊结构是实现核-膜穿梭和磷酸化激活的基础。MCM2-7是进入S期和细胞分裂所必需的。
Title: Bioadhesive chitosan hydrogel with
ROS scavenging promotes angiogenesis and mucosal repair for the treatment of
gastric ulcerAuthors: Panxianzhi Ni, Dengbinpei Duan, Shuting Xiong, Meng
Zhong, Can Huang, Jing Shan, Tun Yuan, Jie Liang, Yujiang Fan, Xingdong ZhangDOI:
10.1016/j.cej.2024.154519胃溃疡（GU）是目前世界范围内最严重、最常见的胃肠道疾病之一，严重影响患者的生活质量。然而，治疗策略有局限性，如药物安全性和缺乏修复特异性。四川大学生物材料国家工程研究中心袁暾研究员课题组（通讯作者）研制了一种用于修复胃溃疡的聚乙烯亚胺/聚丙烯酸/乳糖修饰壳聚糖（PPCL）水凝胶。该水凝胶具有组织黏附力强、溶胀率低、抗胃酸液、抗氧化剂强、生物相容性好等特点，可作为物理屏障，防止胃酸和消化酶进一步破坏溃疡。大鼠GU模型体内数据证实，该水凝胶能有效促进胃溃疡愈合，治疗效果优于市售胃粘膜保护剂。进一步的机制研究发现，水凝胶通过减轻氧化应激、促进再上皮、血管生成和粘膜修复来加速GU愈合。研究结果表明，PPCL水凝胶是一种很有前途的治疗胃溃疡的方法。
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（A）CSLA的合成过程。通过壳聚糖（CS）上的氨基与乳酸（LA）上的羧基之间的酰胺反应制备了三种乳糖修饰壳聚糖（CSLA），CS的氨基与LA的羧基的摩尔比分别为1/1，1.5/1，2/1。（B）PPCL水凝胶制备流程图。10% PEI、10% PAA水溶液和2% （w/v）CSLA或CS溶液以2∶2∶1的体积比均匀混合。通过冷冻干燥和研磨其配合物制备粉体，其能快速吸收去离子水并自发形成PEI/PAA/CSLA-1（PPCL-1）、PEI/PAA/CSLA-2（PPCL-2）、PEI/PAA/ CSLA-3（PPCL-3）和PEI/PAA/CS（PPCS）水凝胶。（C）CSLA的FTIR光谱。酰胺I、酰胺II和酰胺III的峰位分别为1635 cm−1、1535 cm−1和1255 cm−1。酰胺I峰强度的增加（1635 cm−1）表明壳聚糖与乳酸的增加反应导致酰胺化程度的增加。（D）CSLA的XRD谱图。CS出现在2θ = 11°和20°处的两个典型衍射峰。在2θ = 11°处的典型峰被分配给晶体形式I，代表壳聚糖的水合晶体结构。最显著的峰出现在2θ = 20°处，对应于晶型II，这是由于分子结构中许多游离氨基（脱乙酰程度较高）增加了分子间氢键。CSLA在2θ = 20°处只有一个宽峰，而2θ = 11°处的宽峰消失，说明LA修饰后，原始壳聚糖结构中主要的氢键减少，壳聚糖的晶体形态被破坏。（E）CSLA的1H NMR谱。在4.01 ppm处出现了一个新的H质子信号，证实了CS和LA之间的键合。（F）倒置管测定的凝胶时间。各水凝胶的自凝胶时间均小于3 s，且无显著差异。（G）PPCL水凝胶与猪胃的粘附强度。组织粘连对于水凝胶在溃疡表面形成保护以隔离消化道内容物的侵蚀至关重要。使用搭接剪切试验评估PPCL水凝胶的组织粘附性。PPCL水凝胶对猪胃组织的粘附强度均大于20 kPa，明显高于PPCS水凝胶，其中PPCL-3的粘附强度最高。（H）PPCL水凝胶生物粘合剂与组织粘附界面的SEM。放大后的微观结构显示了水凝胶生物粘合剂与组织之间的粘附界面，证实了界面的牢固粘附。（I）PPCL水凝胶粘附在各种材料和组织表面的图像。PPCL水凝胶表现出优异的粘接性能，可以粘接各种表面，如玻璃、聚丙烯、橡胶和钢材。同时，水凝胶与皮肤、胃、肠、肾等脏器组织具有较强的粘附性。（J）制备的水凝胶的热重微分（DTG）曲线。（K）水凝胶热重分析（TGA）曲线。热重分析结果显示，PPCS和PPCL水凝胶的热降解温度分别为369.9、376.4、377.7和380.5 ℃左右。相比之下，PPCL水凝胶增加，说明CSLA的加入增强了交联概率，稳定了内部结构，从而提高了水凝胶的热稳定性。这四种水凝胶在三步减重过程中也表现出相似的降解特征。（L）水凝胶表面和截面的SEM图像。PPCL和PPCS水凝胶内部具有多孔结构，但存在一定差异。PPCL水凝胶的横截面孔径越小，孔隙数量越少，结构越致密均匀，其表面为致密平面，类似于光滑膜，而PPCS凝胶的表面有一些孔隙。这可能是由于CSLA、PEI和PAA链之间的强氢键相互作用导致交联密度高所致。![]()
（A、B）水接触角图像和平均值。PPCL的水接触角明显小于PPCS，且LA对CS的取代度（DS）越高，PPCL的接触角越小。LA的引入提高了水凝胶的亲水性。（C）水凝胶在酸性胃模拟缓冲液中的降解行为。14天后，PPCL-1、PPCL-2、PPCL-3和PPCS水凝胶的降解率分别约为47.19%、43.2%、41.64%和52.9%。PPCL水凝胶的降解速度比PPCS水凝胶慢，说明PPCL水凝胶在胃酸环境中的稳定性得到了改善。（D）水凝胶的溶胀行为。PPCL水凝胶的溶胀率明显低于PPCS水凝胶，并且随着LA在CSLA中CS上的DS的增加而降低。这也说明PPCL水凝胶的交联密度较高，抑制了水凝胶的溶胀。（E-J）DPPH，ABTS和PTIO测定了水凝胶的吸光度曲线和清除率，DPPH和ABTS是典型的氮自由基，PTIO是典型的氧自由基。PPCL组DPPH自由基清除率在80%以上，明显高于PPCS组（64.87%）。随着CSLA中LA对CS的DS增大，水凝胶对DPPH的清除率提高。在ABTS清除率方面也有类似的结果，PPCL水凝胶表现出强大的清除能力，734 nm处的吸收峰消失，经PPCL-1、PPCL-2和PPCL-3水凝胶处理后的溶液颜色变得透明，其对ABTS的清除率在90%以上。PPCL水凝胶比PPCS具有更好的PTIO清除能力，在557 nm处有较弱的吸光度峰，溶液颜色由紫色逐渐变浅，PPCL-3变得透明。（K、L）PPCL水凝胶清除羟基自由基（•OH）和H2O2的能力。•OH和H2O2清除的结果相似，PPCL组的清除率明显高于PPCS组，且PPCL-3水凝胶的清除能力最强。（M）破裂压力试验模型示意图。模型在猪肠内制作直径为2 mm的孔，分别用PPCL和PPCS水凝胶封孔。PBS连续注入装置，直到压力高到足以破裂水凝胶。在此过程中，使用数字压力计记录最大压力。（N）PPCL水凝胶的破裂压力高于PPCS, PPCL-3水凝胶的破裂压力可达135.03 mmHg，明显高于胃内压力（~ 5-25 mmHg）。抗破裂性能的提高可能与PPCL水凝胶的分子间作用力增强有关。LA的引入引入了大量的羟基，这些羟基与PEI的氨基和PAA的羧基反应形成氢键。氢键虽然是弱的非共价键，但氢键协同作用与共价键一样具有强化作用。这种特性对水凝胶保护溃疡的作用特别有益，因为在消化过程中施加在胃组织上的流体压力有时会很高。（O）水凝胶分离胃酸环境效应模型。将水凝胶和模拟消化液（PBS，pH = 1，含胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶）加入Transwell 12孔板的上腔，将PBS（pH = 7.2，不含消化酶）加入下腔。（P）BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上腔消化酶初始浓度为2336.7 µg/mL。1周后，PPCL-1、PPCL-2、PPCL-3和PPCS水凝胶组小鼠下腔消化酶浓度分别为24.75 µg/mL、14.70 µg/mL、7.99 µg/mL和47.91 µg/mL。说明PPCL水凝胶隔离胃消化环境的效果优于PPCS，有利于水凝胶保护和促进溃疡愈合。（A）经水凝胶提取液处理24
h后L929细胞的活力。暴露于PPCL水凝胶的L929细胞存活率在80%以上，表明水凝胶是无毒的。（B、D）经各种水凝胶提取液处理后GES-1细胞和Caco-2细胞的CCK-8测定。光密度（OD）随着时间的推移而增加，表明GES-1和Caco-2细胞系在所有水凝胶提取物中都有增殖。（C）通过细胞FDA/PI成像监测不同处理后GES-1细胞的增殖状态，结果高度一致。孵育24 h、48 h和72 h后，大多数GES-1细胞存活（绿色）并处于健康生长状态，只有少量死亡细胞（红色）存在。随着时间的推移，荧光强度增加表明GES-1细胞明显增殖。（E、F）细胞伤口愈合实验的定量数据和实验图片。PPCL-1、PPCL-2和PPCL-3水凝胶组在12 h和24 h的创面愈合率显著高于PPCS水凝胶组。PPCL-3水凝胶组伤口愈合率最高，在24 h时伤口基本完成愈合。（G-I）Transwell模型评估GES-1迁移的示意图、统计数据和结晶紫染色。Transwell实验显示，PPCL组向腔室下表面迁移的细胞数量高于PPCS组和对照组；随着LA在CSLA中的DS的增加，迁移的细胞数量呈增加趋势。这些结果表明PPCL水凝胶促进了HUVECs和GES-1细胞的迁移，这可能会加速血管生成和损伤胃粘膜的再上皮，促进溃疡愈合。（J）超纯水处理的兔红细胞（阳性对照）呈鲜红色，PPCL和PPCS水凝胶处理的样品呈透明，与PBS缓冲液处理的样品（阴性对照）相似。三种PPCL水凝胶和PPCS水凝胶溶血率均小于5%，说明PPCL水凝胶具有良好的血液相容性。图4：PPCL水凝胶清除细胞内ROS的能力及转录组测序分析（A-C）H2O2分别刺激GES-1、Caco-2和HUVECs细胞诱导氧化应激，同时与水凝胶共培养，6 h后用CCK8测定细胞存活率。与阳性对照组（仅H2O2）和PPCS水凝胶相比，PPCL水凝胶处理的GES -1细胞增殖能力明显提高，其中PPCL-3水凝胶组细胞增殖能力最好。Caco-2细胞和HUVECs细胞的实验结果与GES-1实验结果相似。PPCL水凝胶组细胞增殖明显优于H2O2和PPCS水凝胶组。（D）不同处理下HUVECs中ROS水平的定量。使用ImageJ软件定量计算DCFH-DA荧光面积。PPCL组细胞内ROS含量明显低于H2O2和PPCS组，说明PPCL水凝胶能够清除ROS，缓解氧化应激。（E）不同处理组通过ROS探针（DCFH-DA）检测HUVECs中ROS的缓解情况。对照组没有荧光，H2O2处理后荧光明显增强，说明细胞内产生了大量ROS。加入PPCL水凝胶后，荧光明显减弱，表明PPCL水凝胶有效缓解ROS。（F）转录组学分析Pearson相关热图评估标本稳定性。各组标本的相关系数均在可接受范围内（R2 > 0.95），说明生物重复性好，转录组学数据可用于进一步分析。（G）PPCL与PPCS差异表达基因数量的Venn图。显示PPCL和PPCS共有12665个基因，其中2342个基因表达不同。（H）差异表达基因的火山图。对差异表达基因（DEGs）进行火山图分析。与PPCS相比，PPCL中有443个基因上调，422个基因下调。（I）鉴定的差异表达基因的GO富集分析。PPCL与PPCS中的DEGs参与生长因子活性、氧化还原酶活性、炎症反应调节、血管生成和氧化磷酸化等信号通路。（J）差异表达基因的KEGG富集分析。PPCL的治疗益处与IL-17信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路和氧化磷酸化高度相关。（K）与氧化还原酶活性和生长因子活性相关的基因热图。PPCL水凝胶处理显著上调了氧化还原酶活性和生长因子活性基因，如NDUFB4、NDUFS6、CDNF、BMP6、GDF5和DHRS4。（L）血管生成相关基因热图。PPCL显著增加了促血管生成基因SRPX2、S100A1、ADM2、PTN、TYMP的表达，而降低了NGFR、EPHB3的表达。![]()
（A、B）PPCL水凝胶在体内修复大鼠胃溃疡的示意图和实验图像。使用醋酸性胃溃疡大鼠模型评估PPCL水凝胶在体内治疗胃溃疡的疗效，。在成功构建大鼠胃溃疡模型后，将PPCL、PPCS粉末和磷酸铝凝胶（ALPH）分别应用于溃疡，对照组（Ctrl）不进行任何干预。（C）术后7天PPCL水凝胶形成透明凝胶膜，仍粘附在胃溃疡上。说明该水凝胶在体内可以实现长期的充分粘附。（D）不同治疗后1、7、14天溃疡愈合的宏观照片。（E）不同处理组胃溃疡指数（溃疡最长半径 × 最短半径）。PPCL水凝胶组的溃疡指数在第7天和第14天明显小于PPCS水凝胶组和对照组，在第14天明显小于ALPH组。提示PPCL水凝胶能促进胃溃疡愈合，其治疗效果优于市售胃粘膜保护剂（ALPH）。（F）不同处理后大鼠体重。大鼠在注射醋酸溶液后体重下降。PPCL水凝胶组和ALPH组大鼠的体重增长优于PPCS组和对照组，说明PPCL水凝胶改善了大鼠的生理状态，可能是由于伤口修复较好，食欲增加。（G、H）不同处理组血清中炎症因子IL-6、IL-10的ELISA测定。与对照组相比，PPCL水凝胶显著降低促炎细胞因子IL-6水平，升高抗炎细胞因子IL-10水平。（I-L）抗氧化酶T-AOC和各组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱光肽（GSH）含量。PPCL组在第1天和第7天T-AOC活性显著高于其他各组， SOD活性显著高于对照组。其中，胃溃疡大鼠经PPCL水凝胶处理后，MDA含量在第1天和第7天显著降低，与其他各组在第14天无显著差异。同样，在第7天和第14天，PPCL组的GSH含量显著高于对照组。实验结果表明，PPCL水凝胶具有良好的抗氧化性能，这与体外抗氧化性能的结果一致。（M）1、7、14天后不同处理修复胃溃疡的H&E染色图像。H&E染色显示，1天后各组创面均出现明显的溃疡特征，粘膜层缺损明显，伴有出血、水肿及炎症细胞（以中性粒细胞为主）浸润。治疗7天后，PPCL组溃疡症状较少，炎症水肿明显减轻，新生粘膜增多，对照组、PPCS组和ALPH组仍有许多粘膜病变，包括相当大的粘膜层缺损，大量炎症细胞和水肿。治疗14天后，PPCL组溃疡完全愈合，粘膜结构完好，无炎症浸润。对照组粘膜仍有明显缺损和炎症浸润，PPCS组仍处于粘膜重建阶段，ALPH组溃疡表面基本愈合，下方肉芽组织层突出。图6：PPCL水凝胶修复胃溃疡的免疫荧光和免疫细胞化学分析（A）PPCS、PPCL水凝胶、磷酸铝（ALPH）和对照组（未处理）治疗后胃溃疡切片α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，红色）和CD31（绿色）的免疫染色。（B、C）α-SMA、CD31荧光强度定量。结果显示，PPCL组在第7天和第14天的新生血管数量和成熟度均显著高于PPCS和对照组。（D-G）胃溃疡组织增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki67、Zona Occludens 1（ZO-1）、闭合蛋白（Occludin）免疫组化染色。PCNA和Ki67是反映细胞增殖状态的重要指标。ZO-1和Occludin是胃粘膜上皮细胞间紧密连接的主要结构蛋白，通常被用作判断粘膜完整性和功能的指标。（H-K）定量溃疡中PCNA、Ki67、ZO-1和Occludin阳性细胞的相对百分比。PCNA免疫染色结果显示，第7、14天PPCL组的PCNA表达明显高于对照组，第7天PPCS和ALPH组的PCNA表达也明显高于PPCS和ALPH组。Ki67染色结果与PCNA相似，PPCL组Ki67表达量在各组中最高，且Ki67表达量明显高于对照组。通过分析ZO-1和Occludin在溃疡组织中的表达水平来评估粘膜修复，这两种蛋白是胃粘膜上皮细胞间紧密连接的主要结构蛋白，通常被用作判断粘膜完整性和功能的指标。这些结果表明，PPCL水凝胶增强了ZO-1和Occludin的表达，特别是PPCL组ZO-1的表达在第7天显著高于其他组，这表明PPCL水凝胶有利于促进粘膜修复。提示PPCL水凝胶可促进血管生成、细胞增殖、再上皮和粘膜修复，最终促进胃溃疡愈合。（A）不同分组的PCA。组间样本是分散的，组内样本是聚集在一起的，说明组间差异显著，组内样本具有很好的重复性。（B）三组差异表达蛋白数量的Venn图。PPCL和PPCS共有94个蛋白，351个蛋白表达不同，PPCL和对照共有75个蛋白，329个蛋白表达不同。（C、D）PPCL组与PPCS组、PPCL组与Ctrl组之间蛋白表达差异的火山图。与Ctrl相比，PPCL中有105个上调蛋白和150个下调蛋白，PPCL中有143个上调蛋白和141个下调蛋白。（E、F）PPCL和PPCS组间鉴定的差异表达蛋白（DEPs）的GO和KEGG富集分析。DEPs参与了活性氧代谢过程的正调节、胃肠上皮的维持、上皮细胞增殖的调节、NAD（P）H脱氢酶（醌）活性、单核细胞迁移和免疫应答。（G）PPCL组与PPCS组氧化还原酶活性、细胞粘附与迁移、血管生成和紧密连接相关差异表达蛋白的热图。PPCL水凝胶显著上调了这些相关蛋白，表明PPCL水凝胶可以通过增加氧化还原酶活性、促进细胞增殖、粘附、迁移、加速血管生成和粘膜修复来促进胃溃疡的愈合。（H、I）PPCL组与对照组鉴定的差异表达蛋白的GO和KEGG富集分析。PPCL水凝胶处理显著影响了与GU愈合相关的蛋白质和途径，包括胃肠上皮的维持、伤口愈合的正调节、VEGF信号通路、CAMs、炎症介质对TRP通道的调节、MAPK信号通路、TGF - β信号通路。（J）PPCL组与对照组伤口愈合、细胞粘附和血管生成相关蛋白差异表达的热图。因此，重点研究了与伤口愈合、细胞粘附和血管生成相关的蛋白表达差异，热图显示PPCL水凝胶组中大多数蛋白显著上调。PPCL水凝胶可稳定粘附在溃疡部位，起到物理屏障的作用，防止胃酸和消化酶进一步破坏溃疡。同时，水凝胶可减轻氧化应激，促进细胞增殖迁移和再上皮形成，加速血管生成和胃粘膜修复，最终促进胃溃疡愈合。本文章制备了一种有效修复胃溃疡的黏附性水凝胶，具有组织黏附强、溶肿率低、耐胃酸液、生物相容性好等特点，可以作为物理屏障，阻止胃酸和消化酶进一步破坏溃疡。PPCL水凝胶明显减轻氧化应激，抑制炎症，加速血管生成，促进再上皮和粘膜修复，最终促进胃溃疡愈合。上述研究成果在《Chemical Engineering Journal》上在线发表，题为“Bioadhesive chitosan hydrogel with ROS scavenging
promotes angiogenesis and mucosal repair for the treatment of gastric ulcer”。四川大学生物材料国家工程研究中心和四川大学生物医学工程学院Panxianzhi Ni为论文的第一作者。四川大学生物材料国家工程研究中心袁暾研究员为论文通讯作者。https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154519申明：本微信号转发内容仅做学术交流使用，不作为商业用途，也不代表支持或赞同其观点，如涉及知识产权保护问题或其他方面的问题请及时联系小编，我们会尽快协调处理。本微信号原创文章版权归本微信号所有，欢迎分享到朋友圈等非媒体上。为满足创伤修复产学研各界同仁的要求，本课题组已建立包括创面修复领域顶尖专家、博士、研究生、媒体期刊在内的交流群，全覆盖创伤修复产业及领域。 欢迎加入学生QQ群：群号码565261531（或长按下方二维码）。
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