【Abstract】
2024年6月，国家口腔医学中心北京大学口腔医学院周永胜教授和中国科学院大学纳米科学与工程学院蒲雄团队在期刊【Advanced Materials】上发表题为“Tracing Immunological Interaction in Trimethylamine N-Oxide Hydrogel-Derived Zwitterionic Microenvironment During Promoted Diabetic Wound Regeneration”的研究论文。
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【Result ＆ Figure】
一、水凝胶敷料的合成和表征
通过双网络水凝胶合成方法，制备了三种带不同电荷特性的水凝胶（PA、PC、PZ），主要由GelMA作为基网络。水凝胶的化学结构和特征峰在图1D、1E中展示，图中确认了不同组分的特征峰。（对应图：Figure 1A, 1B, 1D, 1E）通过Zeta电位测试，PZ水凝胶接近电中性，表现出更好的抗蛋白非特异性吸附能力。电位数值见图1F，PZ电荷较弱，符合其化学结构。（对应图：Figure 1F）测试了水凝胶的拉伸和压缩强度，结果显示PZ的弹性模量更适合与伤口表面接触，有助于伤口恢复。数据在图1G中展示。（对应图：Figure 1G）PZ水凝胶的脱水率最低，约为38%，体现出较强的保水能力，适合作为伤口敷料。脱水率数据见图1H，微观结构的EDS成分分布则在支持信息的图S3中展示。（对应图：Figure 1H, Figure S3A-H）![]()
Figure 1.水凝胶敷料的合成和表征。
二、两性离子水凝胶促进糖尿病伤口修复
通过手术去除1厘米全层皮肤，建立糖尿病鼠模型，将PA、PC和PZ水凝胶敷料分别应用于伤口处。伤口愈合过程在第0、3、5、7和15天进行了观察并拍摄图像。（对应图：Figure 2A, 2B, 2C）与PA和PC水凝胶相比，PZ水凝胶在第3、5、7、15天显示了更小的伤口残余面积，说明其更有利于促进伤口愈合。（对应图：Figure 2D）HE染色结果显示，PZ水凝胶处理组在第7天的肉芽组织厚度显著高于PA和PC组，表明PZ水凝胶有助于肉芽组织的形成和伤口愈合。（对应图：Figure 2E, 2F）![]()
Figure 2.PZ 水凝胶糖尿病伤口愈合过程的评估。
三、单细胞图谱揭示了两性离子-水凝胶调节的糖尿病微环境的异质性
通过单细胞RNA测序分析了PA、PC、PZ水凝胶组的细胞类型，聚类分析识别出11个细胞群，包括巨噬细胞和中性粒细胞比例最高，分别占比48.5%和41.1%。不同细胞群的基因表达特征如Arg1、Cxcl1、Mmp9等在图3A、3B、3C中展示。（对应图：Figure 3A, 3B, 3C, S4A, S4B）在糖尿病伤口愈合过程中，早期炎症反应推迟且持续时间较长。实验结果显示PA和PC组巨噬细胞与中性粒细胞比例较高，而PZ组处于中等水平，表明PZ水凝胶能调节炎症反应，维持巨噬细胞与中性粒细胞的平衡，有助于伤口愈合。（对应图：Figure 3E, 3F, S5）![]()
Figure 3.scRNA-seq 分析揭示了第 3 天和第 7 天伤口的细胞异质性。
四、两性离子水凝胶在糖尿病伤口中募集 Ccl3+ 巨噬细胞
对巨噬细胞进行了重新聚类，分为7个亚群（sC1-sC7），每个亚群具有独特的标志基因，如sC1富含Ccl3+等趋化因子基因，sC2富含M1样基因，sC7富含M2样基因。（对应图：Figure 4A, 4B）通过t-SNE和假时序分析展示了巨噬细胞的分化轨迹，Ccl3+细胞在轨迹的起始和结束部分占主导地位。（对应图：Figure 4C, S6A, S6B）PZ水凝胶组中Ccl3+亚群比例较高，并且流式细胞仪分析显示ILR2+ CD63+细胞比例在POD 3和POD 7最高。（对应图：Figure 4D, S7）scEpath分析识别了6个基因簇，其中包含趋化因子、代谢重编程和组织修复相关基因，显示了不同的动态变化趋势。（对应图：Figure 4E, 4F）GO分析显示PZ水凝胶中sC1亚群的中性粒细胞趋化功能上调，NF-κB活性下调，免疫荧光染色显示Ccl3和Egr3在PZ水凝胶组中表达更高。（对应图：Figure 4G, 4H, 4I, S8）![]()
Figure 4.在两性离子水凝胶介导的微环境中鉴定巨噬细胞亚簇。
五、两性离子水凝胶抑制 糖尿病伤口中的 S100a9+ 中性粒细胞
通过重新聚类分析，识别出6个中性粒细胞亚群，其中sC1富含NETs相关基因（S100a9+），sC2为促炎亚群（Cxcl2+），其余亚群分别与脂质代谢、信号传导、ECM重塑和线粒体电子传递相关。（对应图：Figure 5A, 5B）RNA velocity和假时序分析显示，S100a9+亚群位于假时序的前端，NETs形成过程与糖尿病伤口愈合延迟相关。（对应图：Figure 5C, 5E, 5F）PZ组的S100a9+中性粒细胞比例最小，流式细胞仪分析显示CD9+和CD14+细胞比例在POD 3和POD 7也最低。（对应图：Figure 5D, S9）PZ组的NETs标志基因S100a8/a9在假时序轨迹前段高表达，后段逐渐减少，而Slpi逐渐增加，说明PZ水凝胶有助于抑制NETs形成。（对应图：Figure 5G）GO分析显示PZ组的S100a9+中性粒细胞中与ECM组织、抑制Il1α分泌相关的基因上调，而NF-κB和AGE-RAGE信号通路下调，免疫荧光染色显示PZ组Cit-H3和MPO共表达水平较低，代表NETs形成减少。（对应图：Figure 5H, 5I, 5J, S10）![]()
Figure 5.在两性离子水凝胶调节的微环境中鉴定中性粒细胞亚簇。
六、两性离子水凝胶促进糖尿病伤口愈合中巨噬细胞和中性粒细胞之间的相互作用
通过CellChat分析，发现PZ水凝胶组中Ccl3+巨噬细胞与S100a9+中性粒细胞的通信信号更为显著，表明在糖尿病伤口中巨噬细胞-中性粒细胞之间的相互作用占主导地位。（对应图：Figure 6A, 6B, 6C）PZ组中S100a9+中性粒细胞与巨噬细胞之间的相互作用通过Spp1–(ltgα5+ltgβ1)结合减少，Spp1是NETs相关基因，在糖尿病微环境中受到NETs的调控。（对应图：Figure 6D, 6E） 3. Spp1与ltgα5/ltgβ1共表达的免疫荧光验证免疫荧光染色结果显示PZ组中Spp1与ltgβ1以及Spp1与ltgα5的共表达水平较低，进一步证实了PZ水凝胶抑制NETs的作用。（对应图：Figure 6F, S11, S12）![]()
Figure 6.巨噬细胞和中性粒细胞之间的细胞通讯景观。七、两性离子水凝胶通过抑制 NETs 形成和改善血管生成来促进糖尿病伤口愈合
通过皮下注射重组小鼠SPP1蛋白（rmSpp1），研究了PA、PC和PZ水凝胶对糖尿病伤口愈合的影响。结果显示，rmSpp1显著增加了伤口残留面积，但PZ组仍表现出最小的残余伤口面积。（对应图：Figure 7A, 7B, 7C, 7D）免疫荧光染色显示，PZ水凝胶组在rmSpp1处理后仍表现出较低的Cit-H3和MPO共表达，说明PZ组NETs形成最少。（对应图：Figure 7E, S13）PZ水凝胶组HUVECs在管状结构形成实验中显示出更强的血管生成能力，CD31标志物在POD 7时也呈现增加趋势。（对应图：Figure S15A–F）![]()
Figure 7.评估用 PA、PC 和 PZ 水凝胶治疗糖尿病伤口的愈合情况以及 rmSpp1 的给药。
【Reference】
Li Z, Li L, Yue M, Peng Q, Pu X, Zhou Y. Tracing Immunological Interaction in Trimethylamine N-Oxide Hydrogel-Derived Zwitterionic Microenvironment During Promoted Diabetic Wound Regeneration. Adv Mater. 2024;36(33):e2402738. doi:10.1002/adma.202402738
