文献精读：装载干细胞来源线粒体外囊泡的水凝胶微针贴片，可促进慢性伤口愈合

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修复或补偿线粒体功能是治疗放射性慢性创伤的有效途径。然而，缺乏解决线粒体和线粒体输送系统数量的有效治疗策略。北京放射医学研究所的岳文教授，周军年教授和南开大学的韩岩教授（通讯作者）团队设计了一种负载干细胞来源的细胞外囊泡（EVs）和二甲双胍（Met）的脱细胞脂肪基质（DAM）/透明质酸甲基丙烯酸（HAMA）水凝胶微针贴片（Met-EVs@DAM/HAMA-MNP），可用于减轻线粒体功能障碍，并建立了X射线诱导的线粒体功能障碍的体内外模型。研究结果表明Met-EVs@DAM/HAMA-MNP可以显著促进巨噬细胞向具有抗炎和再生功能的M2亚型极化，从而促进皮肤创伤合并辐射损伤小鼠的愈合过程。该系统的有效性已被证明，在临床慢性伤口治疗中具有很大的潜力。

（A）通过光学显微镜观察ADSC（上图）和Met-ADSC（下图）的形态，发现Met治疗没有改变ADSC形态。（B）EVs的隔离流程图：比较用Met治疗以增加ADSC中含有线粒体的EVs（Met-EVs）与来自普通ADSC的EVs（Ctrl-EVs），将第3代ADSC的上清液进行差异离心来分离EVs。（C、D）Ctrl-EVs和Met-EVs的粒径分布范围的NTA和透射电子显微镜（TEM）图像。NTA和TEM显示，两组中的EVs范围在100-1000 nm之间，具有典型的“杯状”形态外观。（E）用基于毛细管的蛋白质水平免疫测定法测定法评估Ctrl-EVs，Met-EVs和ADSCs中的CD9和TSG101表达，证实了EV标志物肿瘤转移抑制因子9（CD9）和肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的表达。（F、G）为明确二甲双胍是否增加了ADSCs分泌的EV中活性线粒体的含量，使用基于毛细管电泳免疫测定法检测Ctrl-EVs和Met-EVs线粒体外膜转位酶 20（Tom20）的表达水平，检测到Met-EVs中的Tom20表达水平比Ctrl-EVs高9.86倍。（H）Ctrl-EVs（28.6%）和Met-EVs（34.6%）中用荧光探针MitoTracker Deep Red FM（MTDR）染色后孵育的CD44MTDR EVs的流式细胞术分析。结果显示，与Ctrl-EVs相比，Met-EVs中CD44MTDR EVs的比例增加。表明通过差速离心制备的ADSC-EVs含有活性线粒体，并且Met处理提高了含线粒体的EVs的百分比。

（A）对Met-EVs和Ctrl-EVs进行4D无标记蛋白质组学分析，以全面分析Met对ADSC衍生的EVs的生物学效应。差异表达蛋白的亚细胞定位分析显示，这些蛋白质中有13.7%来源于线粒体。（B）对上调蛋白的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，结果表明，上调的蛋白质在三羧酸循环途径中的富集程度最高。（C-E）上调蛋白质在生物过程、细胞成分和分子功能方面的基因本体论（GO）分类，结果表明，生物过程中前6个富集途径中的两个参与琥珀酸代谢过程和与线粒体代谢相关的三羧酸循环途径；线粒体呼吸链复合物II是细胞成分中前16个最丰富的通路之一，参与线粒体代谢；16种最丰富的分子功能中有5种，丙酮酸脱氢酶（乙酰转移）、琥珀酸脱氢酶（泛醌）、丙酮酸脱氢酶（NAD）、琥珀酸辅酶A连接酶（GDP形成）和琥珀酸辅酶A连接酶（ADP形成），与线粒体有关。综上所述，在二甲双胍处理ADSC后，与线粒体代谢相关的EVs转运蛋白上调。

（A）Met-EVs处理后巨噬细胞中MTDR标记的外源性线粒体（红色）的代表性共聚焦激光扫描显微图像（CLSM）。在用MitoTracker Green FM（MTG，绿色）预标记的受体巨噬细胞中观察到转移的Met-EVs内的线粒体（白色箭头）。（B）为了进一步证明Met-EVs通过转移活性线粒体改善巨噬细胞线粒体功能障碍，比较了浓度为10⁸粒子/mL的Met-EVs和Ctrl-EVs对X射线辐照（IR）诱导的巨噬细胞线粒体功能障碍的影响。图为与无IR、IR+PBS、PBS、IR+Ctrl-EVs和IR+Met-EVs组进行比较而设置的实验组示意图。（C、D）经不同浓度的Met-EVs处理的X射线损伤巨噬细胞的ATP和活性氧ROS水平。（Met-EVs浓度分别为0，3.0×10⁶，1.0×10⁷，3.0×10⁷，10⁸或3.0×10⁸粒子/mL）。用Met-EVs处理后，ATP水平升高，ROS生成降低，呈剂量依赖性，1.0×10⁸和3.0×10⁸粒子/mL的Met-EVs分别在处理后3和24 h表现出显著效果。（E、F）10⁸粒子/mL浓度的Met-EVs和Ctrl-EVs处理X射线损伤巨噬细胞后的ATP和ROS水平。与未辐照的巨噬细胞（对照组）相比，辐照后3和24小时的巨噬细胞（IR+PBS）出现线粒体功能障碍，证实了ATP生成减少，ROS含量增加，MMP（ΔΨm）降低。（G）使用JC-1试剂盒测定的MMP的代表性图像（JC-1聚集体，红色，生物活性线粒体；以10⁸粒子/mL浓度的Met-EVs或Ctrl-EVs处理X射线损伤的巨噬细胞中的JC-1单体（绿色，线粒体受损）。（H）JC-1聚集体（红色）与红绿荧光总强度（%）之比。综上结果表明，Met-EVs可以通过转移活跃的线粒体来缓解细胞中的线粒体功能障碍，并且这种调节作用优于Ctrl-EVs。

（A、B）不同浓度比下每组水凝胶的平均孔径和压缩模量。平均孔径和压缩模量最大的均为10%HAMA+0.8%DAM组。（C）选择了体积比为10%的HAMA和0.8%的DAM水凝胶（孔径为168.96 μm，杨氏模量为1.75 MPa），在最终浓度为3×10⁸粒子/mL的条件下装载Met-EVs，制备微针贴片（MNP）。图为立体DAM/HAMA-MNP图像。MNP针尖间距、高度和底部直径分别为700、500和270 μm。为了确定在含有液体DAM/HAMA水凝胶提取物的培养基中培养的细胞活力和细胞生长，用在指定时间点（0、24、48、72小时）产生的DAM/HAMA水凝胶提取物处理的人包皮成纤维细胞（HFF）；人脐静脉内皮细胞（HUVECs）；人表皮角质形成细胞（HaCAT）进行活细胞和死细胞测定（D）和CCK-8细胞活力测定（E）。（D）用钙黄绿素AM（绿色）和PI（红色）标记细胞。（F）对装载了Dil标记EVs（红色）的MNP图像进行三维重建，显示EVs在整个MNP中均匀地分布。SEM显示冻干支架材料携带完整的Met-EVs，用黑色箭头表示。表明EVs成功装载到水凝胶中。（G）在体外测量DAM/HAMA水凝胶的降解曲线。大约50%水凝胶在前4天累计释放，12天后还有25%左右残余的水凝胶。（H）体外测量采用比辛胆酸（BCA）法分析Met-EVs@DAM/HAMA的EVs释放曲线。支架材料缓慢降解，EVs逐渐释放，大约80%的EVs在前4天内累积释放。这些结果表明，Met-EVs@DAM/HAMA-MNP具有良好的生物相容性，可以持续有效地将EVs递送到受伤组织。

（A）为了证实Met-EVs@DAM/HAMA-MNPs的治疗效果，建立了C57小鼠背部皮肤辐射联合创面模型，图为放疗结合皮肤伤口模型和治疗策略的示意图。（B、C）用终浓度为3×10⁸粒子/mLMet-EVs的DAM/HAMA-MNP（IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP）治疗模型小鼠，并与DAM/HAMA-MNP联合治疗组（IR+DAM/HAMA-MNP）、PBS联合治疗组（IR+PBS）和PBS未辐照治疗组（无IR）的总愈合率进行比较。结果显示，IR暴露导致小鼠皮肤伤口愈合延迟。而Met-EVs@DAM/HAMA-MNP治疗组显著改善了这种延迟愈合结果。Met-EVs@DAM/HAMA-MNPs组创面愈合时间为术后12天（ POD12），接近无IR组创面愈合时间（POD9）。愈合时间明显快于IR+DAM/HAMA-MNP（POD14）和IR+PBS组。（D）测量了POD6和POD9上每组小鼠伤口面积的比例，在POD6时，IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组（19.75%）的伤口面积显著小于IR+DAM/HAMA-MNP（37.18%）和IR+PBS组（40.07%），而与无IR组相比没有观察到显著差异。在POD9时，IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组表现出的剩余伤口面积百分比（7.53%）显著小于IR+DAM/HAMA组（13.77%）和IR+PBS组（25.84%），尽管它明显高于无IR组（2.57%）。

（A、B）创面组织H&E染色的代表性图像和各组间POD14创面组织上皮厚度的比较。使用H&E和Masson三色染色对POD14上的伤口和周围组织进行组织病理学分析。H&E染色显示，与IR+DAM/HAMA组（56.44 μm）和IR+PBS组（19.15 μm）相比，Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组的上皮明显增厚（92.14 μm）。发现IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组恢复到与未照射皮肤（无IR）组相当的水平（85.45 μm）。这表明IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP治疗促进了小鼠放射损伤后皮肤伤口的愈合。（C）使用Masson三色染色分析I型胶原体积分数评估每组伤口组织胶原沉积情况与H&E结果一致。IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组的胶原蛋白沉积（48.15%）显著高于IR+DAM/HAMA（30.23%）和IR+PBS（14.78%）组。与无IR组（53.02%）相比，未观察到显著差异。Masson对POD14的三色染色显示，IR+PBS组仍有伤口，没有表皮覆盖组织，胶原蛋白沉积明显少于其他组。（D）每组POD14胶原蛋白沉积分数的比较。IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组明显高于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组，而与无IR组无显著差异。（E、F）对POD14上的伤口组织进行了CD31（红色）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（绿色）免疫荧光染色并比较每组中CD31和α-SMA的表达水平。结果表明，与IR+DAM/HAMA-MNP组和IR+PBS组相比，IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组CD31和α-SMA表达显著上调。IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组和无IR组之间未观察到显著差异。

（A）为了评估Met-EVs@DAM/HAMA-MNPs将活性线粒体运输到受伤组织的能力，将MTDR标记的Met-EVs掺入DAM/HAMA-MNPs中，以治疗C57小鼠的背部皮肤伤口。通过免疫荧光染色确定，治疗后3天后切除组织并进行免疫荧光染色，在CLSM下观察到Met-EVs递送的活性线粒体到伤口组织的巨噬细胞（CD68，绿色）、血管内皮细胞（CD31，绿色）、上皮细胞（泛角蛋白，绿色）和肌成纤维细胞（α-SMA，绿色）以及捕获MTDR标记的线粒体（白色箭头）。（B）在POD3和POD7时测量伤口组织的ATP含量。结果表明，IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组伤口组织中的ATP浓度在POD3和POD7上均显著高于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组，但与无IR组无显著差异。（C）在POD3和POD7上测量伤口组织中的ROS水平。用Met-EVs@DAM/HAMA-MNP处理的伤口组织中的ROS含量低于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组，但与无IR组没有显著差异。（D、E）在POD3和POD7伤口组织中M2与M1亚型巨噬细胞的百分比（CD206细胞与CD68细胞的细胞数之比）。IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组创面M2巨噬细胞百分比明显高于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组，而与无IR组无显著差异。这些结果表明IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNPs促进创面组织内巨噬细胞从M1亚型向M2亚型分化。（F）实时荧光定量PCR（qPCR）结果显示，POD7时，IR+Met-EVs@DAM/HAMA-MNP组促炎因子IL-6（IL-6）、IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平显著低于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组；相比之下，抗炎因子Arg1和IL-10在POD7上的表达水平显著高于IR+DAM/HAMA-MNP和IR+PBS组。

Met-EVs@DAM/HAMA-MNPs可以持续有效地将含有活性线粒体的EVs递送到辐照的伤口组织，通过增加皮肤创面ATP的产生、降低ROS含量和氧化应激压力，并促进巨噬细胞从促炎M1亚型向具有抗炎和伤口愈合功能的M2亚型极化来改善线粒体功能障碍。

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