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大面积皮肤缺损的愈合在临床环境中仍然是一个重大挑战。缺乏表皮来源，例如自体皮肤移植，限制了全层皮肤缺损的修复，并导致过度疤痕形成。皮肤类器官具有生成完整皮肤层的潜力，支持缺损区域的原位皮肤再生。上海交通大学医学院附属新华医院骨科张涛等人发表了一份研究，由人角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生的皮肤类器官球体显示出具有被表面角质形成细胞包围的基质核心的特定结构。通过选择合适的生物墨水，并创新地将基于挤出的生物打印技术与双光源交联技术相结合，确保3D生物打印皮肤类器官的整体机械性能。此外，3D生物打印的皮肤类器官经过定制，以匹配伤口部位的大小和形状，便于植入。当应用于免疫缺陷小鼠的全层皮肤缺损时，3D生物打印的人源性皮肤类器官通过原位再生、上皮形成、血管化和抑制过度炎症来显著加速伤口愈合。皮肤类器官和3D生物打印技术的结合可以克服目前皮肤替代品的局限性，为解决大面积皮肤缺损提供新的治疗策略。
相关论文“Integrating organoids and organ-on-a-chip devices” 于2024年9月4日发表于杂志《Bioactive Materials》上。
图1 3D生物打印皮肤类器官的制备，从三种成体干细胞开发的，用于原位修复大型皮肤缺损并提高愈合质量
主要内容
01
角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞自组装形成球形皮肤类器官
研究人员通过将人源性角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞以2:1:1的比例混合培养，形成结构紧凑且分层有序的球体，成功构建了球形皮肤类器官。随着培养时间延长，类器官逐渐增大，外层角质形成细胞高度表达角蛋白，表明其保持增殖活性。核心由真皮成纤维细胞和血管内皮细胞组成，Vim标记表明其间充质来源，且观察到早期血管发生。这一球形皮肤类器官展现出替代大面积皮肤缺损的潜力。
图2 自组装球形皮肤类器官的制备与表征
02
水凝胶的理化性质和生物相容性
研究人员对不同浓度GelMA水凝胶的溶胀性能和流变特性进行探讨，评估其在生物打印中的应用。结果显示，水凝胶的溶胀率与浓度呈负相关，5%和10% GelMA的溶胀能力较强，表现出快速的液体吸收。流变特性表明，随着剪切速率的增加，所有浓度的粘度下降，表现出剪切稀化特征，适合生物打印。在10% GelMA水凝胶中培养的HaCaT细胞倾向于成簇生长，表明其附着能力不强，而在无水凝胶孔板中的细胞表现正常。人皮肤成纤维细胞（HSF）在培养中表现出高活性和增殖，形态逐渐变化，而人脐静脉内皮细胞（HUVEC）也显示出良好的增殖能力，尽管变化较慢。这表明不同皮肤细胞对水凝胶的感知能力不同。随后，研究了不同印刷速度对生物墨水的影响，结果显示较高的挤出速度能提高打印质量。同时，比较了单光源和双光源交联对细胞存活的影响，发现双光源交联在细胞存活方面表现更佳。
图3 水凝胶的理化性质和生物相容性
图4 不同光照策略下载有细胞球的水凝胶样品的生物相容性
03
3D生物打印皮肤类器官加速伤口愈合
研究评估了3D生物打印皮肤类器官在全层皮肤伤口治疗中的效果，使用裸鼠模型创建1cm直径的伤口，并移植三种不同成分的印刷水凝胶。观察期间每4天对伤口进行拍照，结果显示3D打印类器官组在伤口愈合早期与宿主良好结合，伤口无明显炎症反应。从第8天到第12天，所有组的伤口面积逐渐减小，但类器官组的伤口闭合率显著高于其他组。再上皮化过程显示表皮细胞从创伤组织迁移，最终覆盖伤口，恢复保护屏障。图像分析表明，在观察期的最后一天，器官组的伤口面积最小，愈合效果最佳。尽管在第8天之前各组间无显著差异，但到第12天和第16天，3D打印类器官组的伤口闭合显著改善，第16天时伤口面积为原始面积的93.76%，而凝胶组和混悬液组分别为76.06%和75.26%。结果表明，3D生物打印的皮肤类器官能够加速伤口的上皮化过程，促进更快愈合，效果优于传统的水凝胶和细胞悬液。
图5 3D生物打印皮肤类器官促进免疫缺陷小鼠皮肤缺损闭合的疗效观察
04
3D生物打印皮肤类器官可提高伤口愈合质量并促进原位愈合
研究人员还评估了3D生物打印皮肤类器官在促进伤口愈合过程中的效果，利用H&E染色分析了凝胶、凝胶+混悬液和3D打印类器官组在治疗后第8天和第16天的活检标本。结果显示，凝胶组在第8天时观察到大量炎性细胞聚集，表皮细胞排列紊乱，创面未完全愈合。相比之下，3D打印类器官组的伤口结构紧密，表皮细胞排列整齐，炎性细胞较少，血管形成丰富，预示着成纤维细胞的持续增殖和肉芽组织的生长。到第16天，3D打印类器官组的表皮完整，与真皮层粘连良好，形态接近正常皮肤，而凝胶组则未完全愈合。Masson染色显示，三组中胶原纤维结构均存在，3D打印类器官组的胶原纤维排列整齐，且I型和III型胶原在该组表达最高，排列更为规则，表明其有助于提高伤口愈合质量。此外，免疫组化分析显示3D打印类器官组中血管形成更为丰富，血管密度显著高于其他组。总之，3D生物打印皮肤类器官能够有效填充皮肤缺损，增强表皮细胞和真皮胶原蛋白的排列，提高伤口愈合质量，使愈合后的皮肤结构更接近正常皮肤，而非疤痕组织。这些结果表明该技术在皮肤再生领域具有重要应用潜力。
图6 .3D生物打印皮肤类器官修复并通过原位替换提高伤口愈合质量
05
3D生物打印皮肤类器官促进再上皮化和血管化
再上皮化和血管化在皮肤缺损愈合过程中扮演着至关重要的角色。再上皮化涉及角质形成细胞的迁移、增殖和分化，以覆盖并闭合伤口，从而恢复皮肤的屏障功能。在本研究中，通过CD31免疫荧光染色评估了伤口部位的血管生成，并进行了定量分析以计算新生血管密度。结果表明，在所有三个组中均观察到了CD31标记的新生血管，但3D打印类器官组的CD31表达显著高于凝胶组和凝胶+悬浮液组。定量免疫荧光分析进一步确认，3D打印类器官组的血管密度显著高于其他两组（P < 0.01），这表明充足的血液供应对于伤口的愈合和组织修复至关重要。此外，K14的免疫荧光染色结果显示，在3D打印类器官组小鼠的创伤表皮中，K14的表达较高且集中在基底层，指示出表皮干细胞的活跃状态。相对而言，凝胶组和凝胶+悬浮液组的K14表达分散且不均匀，荧光强度明显低于3D打印类器官组。统计分析显示，3D打印类器官组小鼠的表皮厚度显著低于其他两组。
图7. 3D生物打印皮肤类器官生成具有更多新血管形成的紧密堆积的新表皮层
06
3D生物打印皮肤类器官通过抑制炎症加速伤口愈合
通过对不同组（凝胶、凝胶+悬浮液和3D打印类器官组）样本进行转录组学分析，发现打印类器官组有478个转录本上调和204个下调，表明其基因表达显著差异。类器官组的T细胞受体相关信号通路及免疫应答基因显著下调，显示出其在同种异体细胞移植中能够有效促进伤口愈合并降低炎症反应。此外，该组增强了与肌膜完整性相关基因的转录活性，促进了伤口闭合。胶原生物合成关键基因和修饰酶表达的增加反映了细胞外基质重塑的活跃性。KEGG分析显示，3D打印类器官组激活了与炎症调节相关的IL-17、NK细胞介导的细胞毒性和cGMP-PKG信号通路。验证了三维生物打印皮肤器官在加速伤口愈合中的有效性，并探讨其生物学机制。
图8. 3D生物打印皮肤类器官治疗伤口愈合的机制分析
结论
本研究表明，角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的自组装能够成功生成球形皮肤类器官。通过结合挤压生物打印技术和双光源交联技术，设计了一种三维生物打印皮肤类器官，并在免疫缺陷小鼠的全层皮肤缺损模型中应用，显著增强了伤口的治疗效果。结果显示，皮肤类器官能够促进原位愈合、上皮化和血管化，从而提高伤口愈合质量。此外，初步研究发现，皮肤类器官通过调节促炎反应的相关途径，有效加速了伤口愈合过程。这些发现为大面积皮肤缺损的修复提供了新的见解，并为未来的临床应用奠定了基础。
论文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24003748?via%3Dihub
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