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作者：尼奥 | 主编：摩西
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1961年，美国科学家Leonard Hayflick的研究首次揭示，细胞并非永远具有增殖能力，它们会因各种内外压力进入衰老状态。几十年来，科学家们围绕这一现象展开了大量研究，发现这些衰老细胞在许多疾病中起到了推波助澜的作用。
Leonard Hayflick在实验室
为了清除衰老细胞，试图延缓衰老。科学家们提出了”靶向治疗“的策略，但这一策略面临一个核心挑战：我们难以精确区分哪些衰老细胞对健康有益，哪些细胞对身体有害。正因如此，抗衰老疗法可能无意间清除了有益的细胞，反而削弱了人体自然的保护机制，最终得不偿失。
针对这一难题，来自中国科学院大学、上海生物化学与细胞生物学研究所的研究人员近日在权威期刊《Cell》上发表了一篇名为“Identifying specific functional roles for senescence across cell types”的文章，提出了全新的研究思路。他们尝试通过双重组酶遗传系统，精确靶向了不同类型的衰老细胞，并深入探讨了它们在衰老、疾病和再生过程中的具体功能。
前面我们提到，衰老细胞的存在是一种由内外环境的压力所引发的生理状态，其特征包括细胞增殖的终止、特定抑制蛋白（如p16和p21）的表达、细胞衰老标志物（如衰老相关β-半乳糖苷酶）的活性增加，以及一系列炎症因子和蛋白质分泌的增加，这种现象被称为衰老相关分泌表型（SASP）。
衰老细胞存在一系列的特征，因此我们可以识别它们
根据这些特性，研究人员已经开发了许多种方法来识别和标记衰老细胞，其中p16 Ink4a是最常用的标志物之一。p16 Ink4a可以通过抑制CDK4/6，阻止细胞周期从G1期进入S期。科学家利用p16 Ink4a相关的基因工程小鼠模型，能够在活体中检测出衰老细胞的分布。
有趣的是，p16 Ink4a阳性细胞在年轻且健康的组织中几乎无法检测到，但随着年龄的增长或疾病的发展，它们会在老化的组织中逐渐积累。研究表明，通过基因或药物手段清除这些p16 Ink4a+ 细胞，能够延长早衰小鼠的寿命，并在多种老化相关的疾病中显示出积极的效果，例如心脏肥大、动脉粥样硬化、骨质流失、阿尔茨海默病、糖尿病等。
然而，衰老细胞也并不总是“坏人”。一些研究发现，在某些情况下，衰老细胞有助于抑制肿瘤的发生，促进伤口愈合，甚至在胚胎发育中扮演关键角色。此外，它们还能支持某些重要细胞如胰岛β细胞的功能，帮助缓解肺部压力，促进器官再生和细胞重编程。
中科大的最新研究就能帮助我们精准区分不同类型的衰老细胞，通过精确靶向不同类型的衰老细胞，来更好地调控衰老过程，进而改善人类健康。
p16 -tdT小鼠衰老过程中多种细胞类型表达 tdT
研究人员首先需要解决的问题是，搞清楚哪些类型的p16 Ink4a +细胞会在衰老过程中表现出衰老表型。为了解决这个问题，研究团队开发了一种基于荧光的报告基因模型，并将其命名为p16-tdT。简单来说，研究人员会将一个荧光基因盒（tdTomato，简称tdT）插入到Cdkn2a基因的特定位置，以便在细胞中荧光标记那些表达p16 Ink4a的细胞。
通过对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的实验，研究人员验证了这种新模型的有效性。随着细胞传代次数的增加，衰老细胞的标志物如SA-β-Gal也出现了增加，而细胞增殖相关的Ki67却出现了减少，这表明细胞进入了衰老状态。同时，p16 Ink4a的表达出现了显著增加，并且与tdT荧光信号表现一致，这证明这个基因报告系统确实能够准确反映p16的表达水平。
进一步分析显示，这些细胞还表现出其他的衰老标志物，如p21、DNA损伤的γH2AX信号以及IL-6增高和层蛋白B1的减少。
但总而言之，团队通过敲低p16 Ink4a基因表达的实验，验证了该报告系统和抗体的特异性，表明p16-tdT小鼠系能够可靠地追踪和分析细胞的衰老过程。这一模型为接下来研究不同细胞类型在衰老中的作用提供了有力的工具。
巨噬细胞和 EC 是 CCl 4处理后具有衰老特征的主要p16 Ink4a +细胞类型
作为和细胞衰老息息相关的肝纤维化进程，研究人员打算从这个角度入手，研究它们之间的具体关联。谈到肝纤维化，这个疾病实际上是由一种特殊细胞 -- 肌成纤维细胞的过度激活导致的。这些细胞不仅会大量增殖，还会分泌大量的细胞外基质（类似于“身体的胶水”），导致肝脏最终变得硬化和僵硬。
肌成纤维细胞的过度激活在肝纤维化的进程中占了非常大的比重
为了研究衰老细胞对肝纤维化的具体影响，研究人员使用了一种常见的肝损伤模型，通过四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化。他们利用了一种特殊的基因标记小鼠，能显示衰老细胞的位置。实验发现，这种受CCl4处理的小鼠肝脏中，衰老细胞出现了显著增多，而且这些细胞多数都集中在纤维化严重的区域。
通过进一步分析，研究人员确认了在这些区域内，有一些特殊的细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞（血管内皮的组成部分）和巨噬细胞（负责清除体内“垃圾”的细胞），它们都表现出了衰老的特征。这提示这些细胞的衰老可能在肝纤维化的进展中起到了重要的作用。
接着，研究人员利用了更为精细的技术如流式细胞术和单细胞RNA测序，发现巨噬细胞和内皮细胞在纤维化肝脏中占了很大的比例，且这些衰老的细胞表达了大量促炎症因子和组织重塑相关蛋白质，这些物质加剧了肝脏的损伤和纤维化。
最后，研究团队还通过另一种非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的模型验证了这些发现，再次证明了巨噬细胞和内皮细胞的衰老在肝纤维化中的关键作用。总体来说，研究表明，这些衰老细胞通过释放多种炎症因子和组织重塑因子，推动了肝纤维化的发生和发展。
Sn-pTracer 能够以细胞类型特异性的方式对p16 Ink4a +细胞进行谱系追踪
为了通过p16 Ink4a + 巨噬细胞的基因消融技术来改善和逆转肝纤维化的进程，研究人员开发了一种全新的遗传示踪系统，称为“衰老细胞-Cre诱导示踪剂”（Sn-cTracer）。
相比之下，传统的 Sn-pTracer 系统虽然能够追踪细胞衰老，但及其依赖 Dre 驱动器，这种组织特异性的驱动剂难以获得。此外，这种药物还需要持续使用，才能维持对衰老细胞的追踪，但长期使用会增加实验负担，还可能引发未知的健康问题。
为了解决这些问题，新开发的 Sn-cTracer 系统简化了追踪过程，无需长期的药物治疗，且减少了相关的毒副作用。它的设计原理涉及三种小鼠品系：一种细胞类型特异性的Cre驱动程序、p16-LSL-Dre小鼠，以及报告小鼠品系R26-RL-tdT-DTR。通过Cre-loxP系统的激活，能够精准地追踪p16 Ink4a +细胞的动态变化，并实现这些细胞的基因消融。
这种新系统不仅提高了实验的灵活性，还允许在任何特定细胞类型中对p16 Ink4a +细胞进行高效的遗传记录和靶向处理。
消除p16 Ink4a +巨噬细胞可改善肝纤维化
总的来说，该研究通过探究p16 Ink4a +细胞在肝纤维化进程中扮演角色的过程中总结出了以下影响：
巨噬细胞的作用：
p16 Ink4a +巨噬细胞在肝纤维化中发挥了促进作用。这类衰老巨噬细胞表现出衰老相关分泌表型（SASP），分泌的炎症因子和生长因子可能会进一步激活成纤维细胞，加剧纤维化反应。因此，去除p16 Ink4a +巨噬细胞可以有效抑制纤维化进程，限制组织损伤。
内皮细胞的修复功能：
相比之下，p16 Ink4a +内皮细胞在肝脏修复过程中具有保护作用。它们在纤维化后的修复阶段通过维持血管生成和清除代谢废物来帮助恢复肝脏功能。内皮细胞是血管的主要组成部分，它们在保持血液与肝组织间的屏障功能、清除毒素方面起着关键作用。如果去除这些细胞，可能会破坏肝脏微环境，导致废物积累、炎症加剧，并进一步激活纤维化。
VEGF信号的调节作用：
VEGF（血管内皮生长因子）信号在维持内皮细胞的健康功能和促进血管生成方面至关重要。研究表明，通过激活VEGF信号通路，可以防止衰老导致的血管功能下降，从而减少纤维化。尤其是在老年肝脏中，VEGF信号的加强能够恢复衰老内皮细胞的功能，改善血管生成，进而减轻纤维化。
基因调控与肝纤维化的联系：
研究通过在p16 Ink4a +内皮细胞中过度表达Kdr基因，增强了它们的增殖能力，并减少了SASP表达。这种基因调控方式有效提高了内皮细胞的血管生成能力，促进了代谢毒素的清除，减少了纤维化反应。
总体影响：
p16 Ink4a +细胞在肝纤维化中既有促进纤维化的成分（如巨噬细胞），也有修复肝脏的成分（如内皮细胞）。通过有选择性地消除有害的p16 Ink4a +巨噬细胞并增强p16 Ink4a +内皮细胞的修复功能，可以有效减轻纤维化并促进肝脏的恢复。这一发现为未来开发更具针对性的抗纤维化治疗提供了新的方向！
