成管实验（Tube formation assay）

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简介

细胞成管实验（Tube formation assay）是一种体外实验方法，用于研究细胞，尤其是内皮细胞在特定条件下形成管状结构的能力。通常使用基质胶或其他支持性基质作为培养基，细胞在其中接种后，经适宜的生长因子刺激下，能够迁移、增殖并自组装成类似于血管的管状结构。通过观察这些管状结构的形成，研究者可以分析细胞间相互作用、血管生成机制以及相关信号通路。这一实验广泛应用于血管生物学、组织工程、肿瘤研究等领域，为研究细胞功能和疾病机制提供了重要工具。

原理

1、细胞自组装：当内皮细胞（如：人脐静脉内皮细胞，HUVEC）在适宜的基质（如：Matrigel）中接种时，它们能够在特定条件下自行组装，形成管状结构。这种自组装能力源于细胞间的相互作用和基质的物理化学性质。

2、生长因子的作用：在实验中添加的生长因子（如：血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等）会刺激细胞的迁移和增殖，促进管状结构的形成。这些因子通过激活细胞内信号通路，影响细胞行为。

3、细胞-基质相互作用：基质成分（如胶原蛋白、糖胺聚糖等）与细胞表面的受体相互作用，促进细胞的黏附、迁移和形态变化。基质的物理特性（如硬度、粘附性）也会影响管状结构的形成。

4、血管生成模拟：细胞成管实验模拟了体内的血管生成过程。通过观察细胞在体外形成的管状结构，研究者可以探索血管生成的机制及其在生理和病理条件下的变化。

5、定量与分析：实验通常结合显微镜观察和图像分析，对形成的管状结构进行定量评估，包括管道的数量、长度、分支程度等，从而提供关于细胞功能和行为的重要信息。

特点

1、对内皮细胞广泛适用性

内皮祖细胞、转化/永生化内皮细胞（如：小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）、人脐静脉融合细胞（EA.hy926）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC））、原代内皮细胞均能观察到成管结构。

2、血管结构快速形成

内皮细胞将在铺在基质胶后的2-4 h内开始形成小管结构，形成的峰值可能发生在3-12 h之间。管形成持续18-24 h，之后发生细胞凋亡以及管网络解体。

3、可量化

可以统计分叉点（Branch points）和成管长度（Tube length）等实现高通量分析呈现内皮细胞成管能力，结合免疫荧光、基因表达分析等方法，能够深入研究细胞行为和作用机制。

实验步骤

（1）铺基质胶：将基质胶，24孔板和枪头提前放于4 ºC冰箱过夜；24 h后将预冷好的基质胶，24孔板和枪头转移至安全柜的冰盒上，在孔板中加入40 μL的基质胶，并用枪头涂匀在孔板内部，平稳的将孔板转至4 ºC冰箱水平放置10 min，10 min后将孔板转移至室温水平面上放置10 min，最后转移至37 ºC培养箱中放置30 min；

（2）将HUVEC细胞消化重悬至ECM培养基中，以每孔90000个细胞的密度接种在已铺有基质胶的24孔板中，每孔加入 300 μL材料浸提液，在37 ºC，5% CO₂的条件下继续培养6 h；

（3）使用倒置显微镜拍摄细胞的成管情况，并用Image J进行统计分析；

（4）若有需要，可用钙黄绿素（Calcein AM）对成管结果进行荧光染色：移除孔内培养基后，加入50 μL用无血清培养基稀释的Calcein AM（10 Μl Calcein AM+5 mL无血清培养基）， 37ºC，5% CO₂下避光孵育30min，移除Calcein AM，用PBS清洗后在荧光显微镜下观察、采集结果。

常见问题与建议

1、细胞不成管怎么办？

确保细胞活力良好，生长因子的浓度适宜，内皮细胞的代数在2-6代时成管效果最佳，并检查培养环境是否稳定；实验前一天无血清饥饿细胞，第二天成管效果会更好。

2、管状结构不稳定，易解体？

可能是基质胶不适合或者生长因子浓度过高，建议调整实验条件。

3、观察时间过长，细胞过度融合？

尝试缩短观察时间或优化细胞接种密度。

4、基质胶有气泡或成为凝胶状态？

提前将基质胶和所需要的材料（如孔板/枪头等耗材）放在4 ºC，铺板全程在冰上操作；在铺胶时，小心且垂直地将液体移入孔中，避免基质胶液体中出现气泡。

应用示例

1. HUVEC血管形成实验检测NF材料的增强血管生成能力

活细胞和活性因子是组织修复的两大核心要素，直接影响损伤组织的愈合效果。纳米脂肪（NF）可以释放活细胞，例如脂肪干细胞（ADSCs），以及活性生长因子以促进血管生成，从而实现伤口愈合。通过用NF修饰三维仿生短纤维，构建了一种新型的活性电纺短纤维海绵含有ADSCs等活细胞和血管内皮生长因子等活性生长因子，可有效促进HUVEC的管腔形成。在体内，活体海绵可以有效地、持续地作用于伤口，起到仿生活体皮肤的作用，防止体内营养物质的流失，为组织再生创造舒适有利的微环境，促进糖尿病伤口的愈合。因此，通过工程NF的活性电纺短纤维海绵有望通过原位活细胞和受损组织中的活性因子实现伤口愈合。

与对照组相比，NF浸提液共培养的细胞形成的血管网，连接点和节点的数量明显增加，这表明NF浸提液可以增强体外血管生成，从而促进损伤组织修复。

<用NF浸提液共培养HUVEC细胞，通过计数血管网，连接点和节点的数量从而检测血管生成能力>^[1]

2. HUVEC血管形成实验检测DFO材料的增强细胞增殖和血管生成能力

新生血管形成对于改善糖尿病微环境和促进伤口愈合至关重要。然而，过量的氧化应激会阻碍愈合过程。在此，通过 3-羧基-4-氟苯硼酸接枝季铵化壳聚糖的苯基硼酸基团与聚乙烯醇的羟基之间的硼酯基反应制备了一种具有自修复性和可注射性的自适应多功能水凝胶，其中去铁胺（DFO）的促血管生成药物以明胶微球（DFO@G）的形式加载。在全层糖尿病伤口模型中，负载DFO@G的水凝胶通过上调缺氧诱导因子-1和血管生成生长因子的表达来加速血管生成，从而促进胶原蛋白沉积和伤口快速闭合。

用不同浓度的去铁胺DFO培养的 HUVEC 细胞形成实验，并通过计数每组中节点和网格的数量进行定量，与对照组相比，浓度为 3 μM 的DFO对细胞增殖和血管形成均具有显着增强作用。

<用不同浓度的DFO共培养HUVEC细胞，通过计数节点和网格的数量从而检测血管生成能力>^[2] 

3. HUVEC血管形成实验检测NV材料的血管生成能力

研究人员提出了一种新型的核壳透明质酸（HA）微针（MN）贴片，将含有多功能治疗性细胞因子的铁-间充质干细胞衍生的人工纳米囊泡（Fe-MSC-NVs）被封装在MN的内部，用于加速血管生成。将PDA N封装在MN尖端的外壳中，以克服活性氧 （ROS）导致的氧化应激的不利影响。随着皮肤中微针尖端的逐渐降解，PDA NPs在病变处持续释放，以抑制其诱导的炎症反应，而Fe-MSC-NVs显著增加HUVEC的迁移、增殖和血管形成。通过体内实验，Fe-MSC-NVs/PDA MN贴剂显示出良好的糖尿病伤口愈合效果。

铁-间充质干细胞衍生的人工纳米囊泡（Fe-MSC-NVs）在促进HUVEC血管形成方面显示出比来源于间充质干细胞的人工纳米囊泡（MSC-NVs）效率更高，其特征是更明显的管状结构和更多的管数。

<用HUVEC Fe-MSC-NVs和MSC-NVs共培养HUVEC细胞，通过观察管状结构和管数从而检测血管生成能力>^[3]

4.HUVECs的试管形成实验检测FMs、ZFMs的血管生成能力

本文利用锌掺杂的铁基金属有机支架（Fe-MOFs）结构，增强了框架上的羧基，可以在生理环境中保持长期的稳定，而FMs仅在一分钟内就快速分解。锌基金属有机支架（ZFMs）高效灭活耐药大肠杆菌（E. coli），通过上调VEGFα因子加速大肠杆菌感染的伤口愈合，并在体内和体外得到验证。此外，成纤维细胞（L929）在150 μg mL⁻¹ ZFMs孵育48 h后仍保持100%的细胞活力，在动物实验中对重要器官功能的影响可以忽略不计。

锌基金属有机支架（ZFMs）与HUVEC在基质凝胶上共培养10 h后，管状结构明显形成。推测ZFMs可促进成纤维细胞的增殖和血管生成，可能有利于伤口愈合。

<用FMs和ZFMs共培养HUVEC细胞，通过显微镜观察评估金属有机支架的血管生成能力>^[4]

5. HUVEC血管形成实验检测Mg-MOF调节血管形成的活性

研究人员开发了一种镁基金属有机支架的微针贴片（MN-MOF-GO-Ag），可以实现经皮传递和联合治疗糖尿病伤口愈合。镁基金属有机支架（Mg-MOF）与聚（γ-谷氨酸）（γ-PGA）水凝胶混合，加载入MN-MOF-GO-Ag的尖端，Mg在真皮深层缓慢释放Mg²⁺和没食子酸（活性氧清除剂，促进抗氧化）。释放的Mg²⁺诱导细胞迁移和内皮小管形成。

HUVEC在正常细胞培养基（对照）或含有60 μg/mL镁基金属有机支架（Mg-MOF）的细胞培养基或镁基金属有机支架微针贴片提取物（约含有61.4 μg/mL Mg-MOF）的基质胶上培养6 h。与对照组相比，暴露于60 μg/mL Mg-MOF和MN-MOF-GO-Ag提取物的HUVEC的血管形成显著增加。

<用Mg-MOF或MN-MOF-GO-Ag提取物培养HUVEC细胞，孵育6 h后使用显微镜对细胞进行成像>^[5]

总结

体外内皮细胞成管实验，作为探究血管生成机制的黄金标准方法，不仅在生物学研究领域占据重要地位，也是了解内皮细胞分化过程及血管生成蛋白功能的关键手段。该实验通过模拟体内血管生成的微环境，将内皮细胞置于特定培养条件下，观察其在基质胶或其他支持物上的行为变化，尤其是它们如何自发组织形成管状结构的过程。此外，体外内皮细胞成管实验还具有高度的灵活性和可控性，便于研究者进行药物筛选、基因编辑等干预研究，为开发新型血管生成促进或抑制药物提供宝贵的实验依据。

相关参考文献

[1] X. Fu, J. Wang, D. Qian, Z. Chen, L. Chen, W. Cui, Y. Wang.Living Electrospun Short Fibrous Sponge via Engineered Nanofat for Wound Healing. Adv. Fiber Mater. 2022, 23: 979-993.

[2] Z. Shao, T. Yin, J. Jiang, Y. He, T. Xiang, S. Zhou.Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioact. Mater. 2023, 20：561-573.

[3] W. Ma, X. Zhang, Y. Liu, L. Fan, J. Gan, W. Liu, Y. Zhao, L. Sun. Polydopamine Decorated Microneedles with Fe-MSC-Derived Nanovesicles Encapsulation for Wound Healing. Adv. Sci. 2022, 9: 2103317.

[4] D. Zhong, Y. Zuo, Y. Shi, P. Zhang, Y. Xu, B. Li. Right once for all: Zinc-modulated highly stable iron-based ROS generator under physiological conditions for promoting bacteria-infected wound healing. Chem. Eng. J., 2023, 460: 141837.

[5] M. Yin, J. Wu, M. Deng, P. Wang, G. Ji, M. Wang, C. Zhou, N. T. Blum, W. Zhang, H. Shi, N. Jia, X. Wang, P. Huang. Multifunctional Magnesium Organic Framework-Based Microneedle Patch for Accelerating Diabetic Wound Healing. ACS Nano. 2021, 15: 17842-17853.

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