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知识点1 — 脊髓损伤模型构建
脊髓损伤模型的构建方法有多种，常见的几种方法包括：
1、机械性损伤：压迫性损伤：通过施加压力来压迫脊髓。②切断性损伤：通过外科手术切断脊髓，模拟完全性损伤。
2、化学性损伤：注射神经毒素（如马尾素、氟西汀等）导致脊髓神经细胞死亡。
3、电击损伤：使用电流刺激脊髓，造成局部损伤。
4、温度损伤：利用高温或低温对脊髓进行损伤。
常用的动物模型包括小鼠、大鼠和兔子，通过不同的方法在这些动物中诱导脊髓损伤。在选择具体方法时，研究目的、损伤类型以及后续实验要求都是需要考虑的重要因素。同时，构建模型后，通常还需要进行行为学评估、神经功能评估等，以评价损伤的程度和恢复情况。
知识点2 — 神经胶质瘢痕
神经胶质瘢痕是指在脊髓或大脑损伤后，神经胶质细胞（主要是星形胶质细胞和少突胶质细胞）对损伤部位的反应，形成的瘢痕组织。
知识点3 — 神经再生
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能有效保护神经元，低剂量的微管蛋白稳定剂紫杉醇（PTX）能抑制胶质瘢痕的形成，两者联用促进存活的神经元的轴突再生，可以实现受损脊髓的连通，行为的恢复，从而达到有效治疗脊髓损伤的目的。但bFGF和PTX，亲疏水性迥异，两者直接联用困难极大。
在这项研究中，温州医科大学吴疆教授（通讯作者）联合瓯江实验室何华成研究员团队制备了一种组织适应性牛血清白蛋白（BSA）水凝胶，利用白蛋白和PTX的亲和性，和水凝胶中的三维孔径结构，同时包载bFGF和PTX，实现药物的双重释放。该可注射水凝胶可以完美的贴合脊髓损伤的缺口，保护受损的脊髓。在bFGF和PTX的共同作用下，损伤部位神经元得到大量存活并实现轴突的有效再生，最终有效修复脊髓损伤，为临床治疗脊髓损伤提供新的治疗方案和思路。
（A）BSA水凝胶的制备示意图。先利用BSA表面的氨基与含异氰基的硅烷试剂——异氰酸丙基三乙基硅烷（ICPS）反应，得到硅烷修饰后的BSA（ICPS-BSA），然后在添加氟化钠（NaF，碱性条件下可促进白蛋白上的硅酸酯迅速水解交联）后制备BSA水凝胶。BSA 水凝胶的制备是通过甲硅烷基化肽的溶胶-凝胶聚合实现的。（B）BSA与ICPS以不同质量比（1:2，1:3，1:4）混合的胶凝状态。可以看出，随着ICPS比例的增加，BSA与ICPS的混合物从流动性到形成水凝胶。（C）3种不同比例BSA水凝胶的凝胶时间。随着ICPS用量的增加，形成BSA水凝胶体系所需的时间越短。（D）不同BSA水凝胶的压缩性能。与BSA:ICPS=1:2相对较低的最大应力相比，BSA:ICPS=1:3和BSA:ICPS=1:4均表现出较高的力学性能，表明BSA水凝胶具有较高的稳定性。综合上述特点，我们选择了BSA与ICPS的比例为1:3作为制备BSA水凝胶的最佳配比。它的胶凝时间和机械性能对用于SCI治疗的可注射水凝胶候选物是理想的。
（A）BSA水凝胶的SEM图像。观察到BSA水凝胶中具有相互连接的内部三维多孔海绵状网络结构。（B）BSA水凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。在100%应变（1 Hz）和100 Hz应变（1%）下，其G’>G’’值恒定，说明BSA水凝胶具有相对稳定的水凝胶状态。在外加应变和频率下，凝胶-溶胶发生转变（G’’>G’），说明BSA水凝胶具有剪切变薄的特性。（C）BSA水凝胶可注射性。水凝胶在注射后很容易从注射器流出，进入培养皿、玻璃瓶和水中，并保持水凝胶状态，说明其具有优良的剪切减薄性能，这与流变学测试结果一致。（D-F）BSA水凝胶和大鼠正常脊髓组织的力学性能。BSA水凝胶与脊髓组织的压缩应力相当，表明BSA水凝胶具有生物力学上的可比性。（G）BSA水凝胶对大鼠脊髓组织的粘附能力。显示脊髓组织可以很容易地附着在水凝胶上。（H、I）脊髓损伤组织和脊髓损伤后注射BSA水凝胶的组织的力学性能。将BSA水凝胶注射到脊髓损伤部位后，当应变为60%时，脊髓的力学性能恢复到最大应力为20 kPa，说明BSA水凝胶通过增强水凝胶与断裂部位内各向异性的微结构特性融合，可以有效地产生更多的力学各向异性。（J）由电池、灯、BSA水凝胶或脊髓组织组成的电路图。连接BSA水凝胶时，LED灯亮；连接脊髓时，LED灯也会亮起；脊髓组织被切断时LED灯熄灭；脊髓切断后注射BSA水凝胶，LED灯再次亮起，表明BSA具有连接受伤部位的融合能力，且有贴合脊髓的电导率。
（A、B）BSA水凝胶溶血情况的代表性照片和溶血率的统计图。说明BSA水凝胶具有良好的血液相容性。（C）CCK-8测定法用于评估不同稀释比水凝胶的细胞毒性。（D）活/死细胞染色实验。显示水凝胶对PC12细胞的生长无明显影响。（E、F）大鼠皮下埋植28天的BSA水凝胶染色组织切片的H&E和Masson三色染色的代表性图像，几乎没有观察到炎症现象。这些结果表明BSA水凝胶在体内使用是安全的。
（A、B）PC12细胞在不同浓度的PTX和bFGF作用下的生长情况。当PTX浓度降低到25 μg/mL时，几乎不再具有毒性。（C、D）微管相关蛋白2（MAP-2，红色）和神经III类β-微管蛋白（Tuj-1，绿色）的免疫荧光染色图像和原代神经元的轴突长度统计。过氧化叔丁醇（TBHP，用于氧化应激刺激）刺激后，神经元明显收缩，PTX和bFGF联合治疗后，原代神经元状态得到一定程度的恢复。（E）PTX和bFGF保护原代神经元的示意图。bFGF和PTX的组合可以保护原代神经元，促进轴突生长。
（A）bFGF/PTX@BSA水凝胶的制备示意图。将硅酸盐试剂接枝到BSA上以构建ICPS-BSA。再利用PTX与白蛋白的亲和力，将PTX加载到白蛋白上，bFGF嵌入水凝胶中，最后加入NaF，形成了一种包载PTX和bFGF的可注射白蛋白水凝胶（bFGF/PTX@BSA）。（B）bFGF/PTX@BSA水凝胶中bFGF和PTX的释放曲线。bFGF和PTX的释放相对缓慢，缓释性好，没有明显的突释效应，bFGF/PTX@BSA水凝胶可将药物释放延长至15天。（C）在SCI部位局部给予 bFGF@BSA 水凝胶的示意图。（D）体内活体成像分别观察游离bFGF和包载在BSA水凝胶中的bFGF在脊髓损伤部位的滞留时间。（E）BSA和bFGF在脊髓损伤部位的荧光共定位。这些结果显示BSA水凝胶可以有效延长bFGF在脊髓损伤部位的保留时间，有助于bFGF长期发挥药效。
（A、C）损伤后28天来自脊髓横切的H&E染色和Nissl染色的代表性图像以及腹侧运动神经元（VMNs）数量。SCI组在脊髓损伤中心出现严重的损伤和突出的空洞，结构混乱，运动神经元较少，而经bFGF/PTX@BSA治疗后，显著降低了损伤面积，且结构更加紧密，VMNs增加。（B）损伤后28天时每组的脊髓纵切面H&E染色。（D）从H&E染色定量脊髓纵切面的病变区域。与假手术组（Sham）相比，SCI组大鼠中央灰质和背侧白质明显受损，损伤部位出现明显萎缩、囊腔和空洞，神经元数量和VMNs显著减少。bFGF/PTX@BSA水凝胶组损伤恢复较好，组织结构完整，萎缩显著减少。结果表明，bFGF/PTX@BSA水凝胶可以减少损伤组织中神经元的丢失，改善损伤组织的病理形态。
（A）脊髓损伤后28天，胶质纤维酸性蛋白（GFAP，红色）、神经丝蛋白-200（NF-200，绿色）免疫荧光染色图像。（B）NF-200荧光面积（NF-200阳性纤维区/白色虚线内病变区）的定量统计。GFAP和NF-200共染，观察神经丝突破瘢痕的延伸。脊髓损伤组可见少量NF-200阳性轴突穿过胶质瘢痕，PTX治疗组、bFGF/PTX治疗组和bFGF/PTX@BSA治疗组可见许多NF-200标记的纤维穿过胶质瘢痕，并出现延长的轴突。（C）脊髓损伤后28天，MAP-2（绿色）、Ace-tubulin（红色）和GFAP（白色）免疫荧光染色图像。（D）MAP-2的荧光定量统计。Ace-tubulin是评价微管稳定性的经典指标，MAP-2蛋白则是微管相关蛋白。结果显示bFGF/PTX@BSA水凝胶组Ace-tubulin穿过瘢痕的表达最明显；同时，MAP-2蛋白在bFGF/PTX@BSA水凝胶治疗后在损伤区域荧光最强。（E）bFGF/PTX@BSA促进轴突穿过瘢痕的示意图，bFGF/PTX@BSA水凝胶能显著改善神经元细胞微管稳定性。
（A）脊髓损伤后28天，生长相关蛋白-43（GAP-43，绿色）、GFAP（红色）免疫荧光染色图像。（B）各组中GAP-43的蛋白质表达和定量数据。采用免疫荧光染色和Western blotting检测各组神经再生经典指标GAP-43的表达水平。bFGF/PTX@BSA表现出最高的GAP-43 水平，GAP-43 阳性神经细胞遍布神经胶质瘢痕GFAP区。GAP-43的WB进一步证明了bFGF/PTX@BSA对神经元再生的影响。（C）脊髓损伤后28天，GFAP（红色）、神经/胶质抗原2（NG2，绿色）、神经黏蛋白（Neurocan，紫色）免疫荧光染色图像。（D）脊髓损伤28天后各组中NG2和Neurocan的蛋白表达及统计结果。Neurocan和NG2由反应性星形胶质细胞分泌，通过形成致密的神经胶质瘢痕来抑制轴突生长。免疫荧光和WB结果表明，bFGF/PTX@BSA对NG2和Neurocan的抑制作用最好。bFGF/PTX@BSA 水凝胶可有效减少神经胶质疤痕并促进轴突再生。
（A）脊髓损伤后28天，各组的Bcl-2和Bcl-2/Bax蛋白表达和定量统计。SCI组Bcl-2（一种凋亡抑制蛋白）的低表达和Bax（一种促凋亡蛋白） 的表达最高，表明SCI区域的细胞凋亡。bFGF/PTX@BSA处理后，Bcl-2增强，Bax表达降低，表明bFGF/PTX@BSA抑制SCI后细胞凋亡。（B）脊髓损伤后28天，Tunel细胞凋亡检测（Tunel，绿色）的免疫荧光染色图像。（C）Tunel阳性细胞的统计结果。由于损伤后细胞凋亡，SCI组表现出最高的Tunel阳性细胞，而bFGF/PTX@BSA显着减少了Tunel阳性细胞的数量，表明bFGF/PTX@BSA确实减轻了SCI部位的细胞凋亡。（D）脊髓损伤后28天，神经元细胞核（NeuN，红色）、Caspase 3裂解（c-Caspase 3，绿色）免疫荧光染色图像。bFGF/PTX和bFGF/PTX@BSA显示c-Caspase 3与NeuN的共表达最少。总之，bFGF/PTX@BSA水凝胶可通过抑制细胞凋亡，有效促进神经元存活，保护神经元。
（A）各组大鼠在损伤后第28天的爬行VCR。（B）Sham、SCI组、PTX组、bFGF组、bFGF/PTX组、BSA水凝胶组和bFGF/PTX@BSA水凝胶组大鼠在损伤后第28天的脚步印迹。（C）各组损伤后第28天的Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动评分。（D-F）足部误差、重量支撑（量化为躯干离地面的高度）、痉挛的统计图。数据显示SCI严重影响了大鼠的运动功能，后肢无法有效支撑体重。治疗后，大鼠部分恢复，后肢运动改善，但仍无法有效承载身体的重量。在bFGF/PTX@BSA处理组中，大鼠后肢的运动功能明显恢复，大鼠可以有效地支撑自己的体重，并表现出更连贯的互动运动。说明bFGF/PTX@BSA可以显著促进SCI的恢复。（G-K）脊髓损伤28天后，各组中AMPK、mTOR、ULK-1和LC-3II的蛋白表达及统计。我们还研究了bFGF/PTX@BSA促进SCI恢复的分子机制。正如之前的研究发现，生长因子通过自噬参与SCI恢复。检测各组与自噬相关的蛋白表达，发现SCI组自噬高度激活，AMPK、ULK1和LC3-II的表达升高和mTOR的表达降低。自噬的过度和持续激活会导致组织损伤和自噬细胞死亡，从而恶化SCI。相比之下，bFGF/PTX@BSA通过上调mTOR的表达和下调AMPK、ULK1和LC3-II的表达，显著降低SCI后自噬激活，自噬水平的降低导致了神经保护作用和较少的细胞凋亡，最终促进了损伤脊髓的神经和功能恢复。综上所述，表明bFGF/PTX@BSA通过AMPK/ULK1/LC3通路抑制过度自噬，从而增强SCI愈合。
综上所述，本研究开发了一种新型牛血清白蛋白（BSA）水凝胶，其具有优异的粘附性、可注射性和生物相容性。通过与蛋白质疏水区结合将PTX包埋在BSA水凝胶中，然后通过BSA-ICPS的溶胶-凝胶转变将bFGF包封在水凝胶基质中，形成bFGF和PTX共负载的BSA水凝胶（bFGF/PTX@BSA）。系统地研究了水凝胶的外观形态、力学性能、可注射性、流变性能、导电性、生物相容性和药物释放特性。体内研究表明，通过bFGF/PTX@BSA系统通过保护受损的神经元，抑制胶质瘢痕形成，促进轴突再生，减少神经细胞凋亡，改善了脊髓损伤后大鼠的运动功能。这些结果表明，bFGF/PTX@BSA是修复脊髓损伤的理想功能化材料，具有广阔的应用前景。
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