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知识点1 — 近红外二区（NIR-Ⅱ）光敏剂
1.定义：NIR-Ⅱ光敏剂是指能够在近红外二区波长范围内被有效激发并产生相应光学或生物学效应的光敏材料。
2.应用：
（1）肿瘤成像：利用近红外二区光敏剂进行肿瘤成像，可以实现实时、高分辨率进行肿瘤监测，为肿瘤诊断和治疗提供重要依据；（2）光动力治疗（PDT）：光动力治疗是一种利用特定波长的光来激活光敏剂分子，使其产生具有细胞毒性的活性氧物质来杀灭肿瘤细胞的方法；（3）光热治疗（PTT）：部分近红外二区光敏剂还具有光热转换能力，能够在近红外二区光照射下产生热量，通过热效应杀灭肿瘤细胞。
知识点2 — 供体-受体-供体（D-A-D）型结构
1.结构特点：D-A-D型结构由电子供体（Donor, D）单元、电子受体（Acceptor, A）单元以及另一端的电子供体单元组成。这种结构类似于有机光电材料中常见的D-A结构，但通过在两端引入供体单元，形成了D-A-D的夹心结构。有利于分子内的电荷转移和能量传递，从而调控材料的光电性能。
2.应用：
（1）光电材料：D-A-D型结构在光电转换材料、有机太阳能电池等领域具有潜在应用前景。通过优化结构设计，可以提高材料的光电转换效率和稳定性；
（2）光催化：某些D-A-D型材料能够吸收光能并将其转化为化学能，促进光催化反应的发生。这种特性在环境治理、能源转化等领域具有广阔的应用前景；
（3）生物成像：D-A-D型荧光分子能够在特定波长光的激发下发出荧光信号，实现对生物样品的高分辨率成像；
（4）光敏剂：特别是在近红外二区（NIR-Ⅱ）荧光染料的研究中，D-A-D型结构能够实现更深的组织穿透和更高的成像分辨率，适用于肿瘤诊断、成像引导手术等生物医学应用。此外，部分D-A-D型光敏剂还能够在光动力治疗中发挥重要作用，通过产生活性氧物质来杀灭肿瘤细胞。
知识点3 — 酶联免疫吸附试验（ELISA）
1.原理：（1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。（2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
2.步骤：在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法具有较高的灵敏度。
3.方法类型：（1）双抗体夹心法、（2）双位点一步法、（3）间接法测抗体；（4）竞争法、（5）捕获法测IgM抗体应用。
Title： Development of D–A–D-Type NIR-Ⅱ Photothermal Agents for Synergistic Eradication of Multidrug-Resistant Bacteria and Promoting Diabetic Wound Healing
Authors： Ji Liu, Yuxin Wang, Weijie Gao, Mingyi Cao, Haojun Bian, Shiya Wang, Lijuan Gui, Changhui Zhao, Yueqing Gu, Qifeng Zhong,* Jinrong Zheng,* Li Zhang,* Zhenwei Yuan*
Adv. Funct. Mater
DOI：10.1002/adfm.202411986
引言
治疗由耐药性细菌引起的糖尿病足感染的挑战是如何快速根除细菌并加速伤口愈合。NIR-Ⅱ诱导的光热疗法（PTT）具有优于常规治疗的显着优势，例如广谱杀菌效果，在生物组织中更好的渗透深度和更高的皮肤耐受阈值，使其特别适合治疗糖尿病足感染。其中，NIR-Ⅱ染料1-苯并硫代高氯酸（IR26）已被发现具有良好的光热效果，但光热稳定性较差。通过用甲氧基和三苯胺基团修饰IR26，开发了一种新型的D-A-D型NIR-Ⅱ小分子光热剂（IRC），具有高光热稳定性和光热转化率（44.3%）。然而，单独使用PTT不能有效促进糖尿病伤口愈合。
在本研究中，中国医科大学仲启凤副教授、厦门大学郑锦荣研究员、张丽教授和袁振伟副教授（通讯作者）团队通过将IRC和促伤口愈合的天然产物姜黄素（Cur）混合到热敏脂质体中，开发了一种新型纳米平台Cur-IRC@PCM NPs，以治疗MRSA感染的糖尿病伤口。在980 nm激光照射下，Cur-IRC@PCM提供了PTT并精确实现Cur的可控释放，从而有效地协同消除耐药细菌并加速了伤口闭合。智能抗菌纳米平台Cur-IRC@PCM还具有出色的生物相容性，使其成为生物医学领域对抗耐药细菌感染的有较好前景的治疗工具。
（A）D-A-D型NIR-Ⅱ小分子IR26、IRA、IRB和IRC（IRA、IRB和IRC是使用IR26的结构修饰合成的具有D-A-D结构的新型NIR-Ⅱ染料）的化学结构。（B）PCM脂质体、Cur@PCM、IRC@PCM和Cur-IRC@PCM NPs的合成方案。（C）Cur-IRC@PCM NPs的示意图用于治愈MRSA感染的糖尿病伤口的示意图。
（A）已报道的具有D-A-D结构的有机小分子NIR-Ⅱ染料的化学结构。大多数染料的吸收波长< 1150 nm，发射波长< 1200 nm。（B）IR26、IRA、IRB和IRC的化学结构。（C-F）IR26（C）、IRA（D）、IRB（E）和IRC（F）在二氯乙烷中的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。与IR26的最大吸收峰（1080 nm）相比，在IRA和IRB中引入甲氧基使其最大吸收峰分别红移至1100和1095 nm。在IRC中引入三苯胺基团导致的红移最为显著，最大吸收峰在1166 nm处。荧光发射光谱表明，IRA和IRB的最大发射波长分别位于1154和1140 nm，与IR26（1130 nm）相比略有红移。
（A-D）IR26（A）、IRA（B）、IRB（C）和IRC（D）（浓度为20 μM）在DMSO溶剂中，在不同功率密度（0.4、0.8和1.2 W/cm2）的808 nm激光辐照下的光热曲线；在20 μm的化合物浓度和1.2 W/cm2的激光功率密度下，IR26的溶液温度升高了32 ℃，而IRA和IRB分别升高了26和25 ℃；值得注意的是，IRC显示出最高的光热温度变化（Δt = 36 ℃）。（E-H）IR26（E），IRA（F），IRB（G）和IRC（H）（浓度为20 μM）在DMSO溶剂中，于808 nm（0.8 W/cm2）激光照射下持续360 s，随后进行自然冷却过程的光热加热曲线；IR26、IRA、IRB和IRC的PCE（光热转化效率）分别为37.4% 、36.0% 、39.9% 和44.3%，IRC表现出最高的PCE。（I-L）IR26（I），IRA（J），IRB（K）和IRC（L）（浓度为20 μM）在DMSO溶剂中的光热循环测试。IR26和IRA的峰值温度在光照和冷却的第二个周期中下降，而IRB的峰值温度从第四个周期开始下降，表明在光热效率所需的温度下，IR26，IRA和IRB的光稳定性差。相反，IRC在五个周期内的峰值温度显示出轻微的波动，表明具有更好的光稳定性。（M-P）IR26（M）、IRA（N）、IRB（O）和IRC（P）（浓度为20 μM）在DMSO溶剂中，于不同功率密度（0.4、0.8和1.2 W/cm2）的980 nm激光辐照下的光热曲线；IRC的Δt从37 ℃升高至52 ℃，从而突出了其作为光热剂的巨大潜力。（Q）IR26，IRA，IRB和IRC在DMSO溶剂（浓度为20 μM）中，在980 nm（0.8 W/cm2）激光照射下的光热图像；IRC表现出最大的Δt，达到63 ℃的最高温度。因此，IRC成为进一步光热研究的最佳候选者，选择980 nm激光进行后续激发。
（A-C）Cur@PCM（A）、IRC@PCM（B）和Cur-IRC@PCM NPs（C）的尺寸分布和透射电镜图像。比例尺为150 nm。结果表明，Cur@PCM、IRC@PCM和Cur-IRC@PCM NPs的平均粒径分别为135、150和110 nm。（D）PCM NPs的Zeta电位。三种脂质囊泡的Zeta电位值分别为32.9、38.1和34.8 mV，证实了脂质NPs的成功制备。（E-G）Cur@PCM（E）、IRC@PCM（F）和Cur-IRC@PCM NPs（G）的稳定性。Cur@PCM、IRC@PCM和Cur-IRC@PCM NPs在室温下7天内均表现出良好的稳定性。（H）PCM NPs在980 nm激光辐照下（0.8 W/cm2）的光热加热曲线。Cur@PCM的温度仅增加了9 ℃，而IRC@PCM的温度增加了31 ℃，其中Cur-IRC@PCM NPs表现出最佳的光热效果 (Δt = 38 ℃)。（I）PCM NPs在980 nm激光照射下（0.8 W/cm2）随时间变化的光热图像。红外成像结果证实，在980 nm激光照射下，Cur@PCM和PBS显示出可忽略的温度变化。相反，IRC@PCM和Cur-IRC@PCM NPs在照射2分钟后均显示出与脂质体相变温度相关的温度，从而诱导脂质体溶解和随后的药物释放。因此，负载IRC的热敏PCM脂质体表现出优异的PTT效果。（J、K）在pH = 7.4（J）或pH = 5.5（K）的980 nm激光照射（0.8 W/cm2）下，PCM NPs随时间的药物释放特性。不同PCM NPs的Cur和IRC浓度分别为30和50 μg/mL。连续激光照射120 s后，IRC@PCM和Cur-IRC@PCM NPs的药物释放达到50%，长时间激光照射360 s，药物释放接近100%。然而，未装载IRC的Cur@PCM NPs姜黄素的释放最少，释放<15%。
（A-C）与Cur@PCM（A）、IRC@PCM（B）和Cur-IRC@PCM NPs（C）在37 ℃不同条件下孵育24小时的HUVEC的细胞活力。在黑暗和阳光条件下，用三种PCM脂质体处理的HUVECs的细胞存活率与PBS组相似，表明它们的影响最小；在980 nm激光照射下，Cur@PCM组的细胞活力保持不变，表明脂质体膜结构没有发生相变和溶解。相比之下，由于激光照射后产生的高温，IRC@PCM在50 μg/mL的浓度下诱导约50%细胞死亡。（D-F）有/无980 nm激光照射（0.8 W/cm2）的条件下，在不同浓度的Cur@PCM（D）、IRC@PCM（E）和Cur-IRC@PCM NPs（F）存在下，于OD600 nm检测MRSA的细菌活力。在Cur@PCM治疗组中，由于没有达到药物从脂质体释放所需的相变温度，未照射和照射条件都不能有效根除细菌。在较低的IRC@PCM浓度下，光热效应引起的温度升高对细菌根除无效；然而，在50 μg/mL时，由于有效的PTT效应，达到了约60%的细菌根除率。无论是光照的还是非光照的Cur-IRC@PCM NPs组，在低浓度下均显示出抑菌效果。但是，在IRC浓度为50 μg/mL和Cur浓度30 μg/mL时，在980 nm激光照射下的Cur-IRC@PCM组的MRSA死亡率超过90%，表明具有非常显著的杀菌作用。（G-I）有无980 nm激光照射（0.8 W/cm2）的条件下，在不同浓度的Cur@PCM（G）、IRC@PCM（H）和Cur-IRC@PCM NPs（I）存在下，使用CCK-8（OD450 nm）检测MRSA的细菌活力。结果与OD 600 nm一致；（J）在有无980 nm 激光照射（0.8 W/cm2）处理后的MRSA琼脂板图像。由于Cur未成功释放，Cur@PCM处理组在980 nm激光照射下还显示细菌生长旺盛的结果；而由于光热效应，用IRC@PCM处理组表现出细菌菌落的显著减少。
（A-C）在有/无980 nm激光照射（0.8 W/cm2）的条件下，在不同浓度的Cur@PCM（A）、IRC@PCM（B）和Cur-IRC@PCM（C）存在下于OD260 nm检测MRSA核酸泄漏水平。（D-F）在有/无980 nm激光照射（0.8 W/cm2）的条件下，在不同浓度的Cur@PCM（D）、IRC@PCM（E）和Cur-IRC@PCM（F）存在下于OD280 nm检测MRSA蛋白泄漏水平。在Cur@PCM组中，OD260 nm和OD280 nm读数没有显著变化，表明没有核酸和蛋白质渗漏。相反，在IRC@PCM和Cur-IRC@PCM治疗组中，在980 nm激光照射下，OD260 nm和OD280 nm显着增加，这表明PTT和药物释放的结合破坏了MRSA膜，导致细胞内容物的泄漏。（G）在有/无980 nm激光照射 (0.8 W/cm2) 的情况下，MRSA与不同的PCM脂质体共孵育的SEM图像。比例尺为500 μm；PBS和Cur@PCM组表现出完整而光滑的表面，而IRC@PCM和Cur-IRC@PCM处理组中的细菌表现出粗糙和破裂的表面，表明总体形态受损。
（A）MRSA感染的糖尿病伤口模型的构建和愈合过程的示意图。（b）MRSA感染的小鼠在第0、3、6、9、12和15天接受不同治疗的伤口愈合过程的代表性图像。到第15天，因为糖尿病小鼠的免疫能力较弱，伤口中存在过量的葡萄糖，PBS和Cur@PCM治疗组的小鼠仍然有较大的未愈合伤口；与未照射组相比，IRC@PCM组和Cur-IRC@PCM组小鼠在980 nm激光照射后伤口面积明显减少；Cur-IRC@PCM组在第15天表现出外表皮伤口的完全愈合，表明通过协同PTT和Cur治疗的非常显著的抗菌治疗效果。（C）不同组治疗MRSA感染的伤口表面愈合的轨迹图。（D）用不同的治疗方法处理MRSA感染的小鼠的相对伤口大小。万古霉素组的伤口仅减少了约62%，而IRC@PCM+NIR组的伤口减少了约70%，表明细菌根除在一定程度上促进了伤口愈合，IRC@PCM+NIR组的效果最佳。（E）在第0、3、6、9、12和15天进行不同治疗的MRSA感染的糖尿病足大鼠的伤口愈合过程的代表性图像。（F）不同治疗MRSA感染的糖尿病足大鼠创面愈合的轨迹图。（G）用不同材料治疗的MRSA感染的糖尿病足大鼠的相对伤口大小。在Cur-IRC@PCM照射组中观察到显著的治疗效果，其中伤口面积几乎减少到零，显示伤口完全愈合。
（A）HUVECs细胞的伤口划痕实验图像。Cur-IRC@PCM组在24小时细胞间隙明显减少，表明促进细胞愈合的潜力。（B-G）使用ELISA法定量分析第15天伤口的CD86（B），CD80（C），CD206（D），IL-1β（E），THF-α（F）和IL-6（G）表达，在第15天治疗的小鼠皮肤组织Cur-IRC@PCM组中，CD86和CD80表达水平下调，而CD206显示出显著的上调以及TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平的下调。说明Cur-IRC@PCM降低了组织的炎症反应。（H）在第15天用不同组处理的皮肤伤口组织中M2巨噬细胞（CD86）和M2巨噬细胞（CD206）的代表性免疫荧光图像，比例尺50 μm，皮肤组织切片的免疫荧光染色显示治疗后巨噬细胞向M2型极化。
综上所述，本文开发了一种新型的NIR-Ⅱ光热剂。通过将Cur包裹在PCM脂质体中，获得了Cur-IRC@PCM智能抗菌平台。该平台被用于快速有效地治疗耐药细菌感染的糖尿病伤口溃疡。在980 nm激光照射下，Cur-IRC@PCM组表现出有效的PTT和精确的Cur释放，从而协同破坏细菌膜并消灭细菌。在感染MRSA的糖尿病小鼠模型中，Cur-IRC@PCM组促进细胞增殖，M2巨噬细胞极化和胶原蛋白沉积，从而加速伤口愈合，它有效地消除了影响组织修复过程的细菌。此外，Cur-IRC@PCM表现出优异的生物相容性，没有任何明显的毒性影响。
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