在类器官芯片（Organoid-on-a-chip）或串联共培养系统上进行微生物共培养，是一种前沿的实验技术，能够更好地模拟生物体内微环境，观察微生物与宿主细胞或其他微生物之间的复杂相互作用。这类培养系统更加接近生理状态，能够提供传统培养模式难以实现的动态流体环境和微结构。
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材料与设备
1. 类器官芯片系统
微流控芯片：一个用于细胞和微生物共培养的多腔体芯片，带有流体通道、栓塞部件等（例如Future Mind、Bruina等 公司的芯片）。
泵系统：用于维持微流控芯片中的流体流动，提供持续的营养物质和废物清除（例如蠕动泵或压力驱动的泵系统）。
类器官或细胞系：来源于患者或实验模型的类器官（例如肠道、肺等）或宿主细胞系（例如Caco-2肠上皮细胞、A549肺上皮细胞）。
微生物菌株：目标微生物菌株，需经过预培养，如肠道共生菌（大肠杆菌）、病原菌（沙门氏菌）等。
2. 介质和培养基
细胞培养基：适合类器官或细胞生长的培养基（例如DMEM、高糖培养基等）。
微生物培养基：适合微生物生长的培养基（例如LB培养基、MRS培养基等）。可以混合或分层提供给不同腔体。
缓冲液：如PBS，用于洗涤和去除未结合的细胞或菌体。
3. 实验设备
培养箱：37°C，5% CO₂。
显微镜：用于实时观察细胞和微生物在芯片上的状态。
流体控制系统：如压力泵、流速调节器等。
无菌操作台：用于无菌操作。
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实验步骤
1. 准备类器官芯片
芯片预处理：
•将芯片在无菌环境下进行预处理，根据芯片设计，可能需要在表面涂覆细胞外基质（如Matrigel、胶原蛋白等），以帮助类器官或细胞贴壁和生长。
•在芯片中注入培养基，并使用流体泵或重力流动系统，确保培养腔体内介质循环良好。
细胞或类器官接种：
•将类器官或细胞悬浮在合适的培养基中，然后通过无菌注射器或移液器将其注入芯片的细胞培养腔中。
•静置数小时或过夜，等待细胞贴壁或类器官在腔内结构中稳定生长。
2. 微生物接种与共培养
微生物预培养：
•根据实验目标，先在液体培养基中培养目标微生物，达到对数生长期（例如OD600 0.4-0.6），确保微生物活力。
•选择合适的微生物培养基，部分实验需要将微生物与宿主细胞分离培养，或者在流动环境下接触。
微生物接种：
•将微生物悬液注入芯片的微生物培养腔。根据设计，微生物可以直接接触类器官，或者通过半透膜与宿主细胞间接接触。
•如果是串联培养系统，可先将微生物注入一个独立腔体，再通过流体连接该腔体与类器官腔体，实现动态共培养。
控制流体流动：
•设定流速：通过泵系统，调节芯片中的流体速度，常见流速范围为0.1-10 µL/min。流速应根据细胞类型和微生物生长特性调节，避免过快冲走微生物或细胞。
•确保各培养腔体间的流体相互作用能够模拟生理环境，保持营养供应及废物清除。
3. 培养与监测
培养条件：
•将芯片置于37°C，5% CO₂培养箱中，持续培养数小时至数天，具体时间根据实验需求。
•定期更换或补充培养基，保持良好的营养供应，尤其在长时间培养时，确保没有酸化或营养耗尽的情况。
实时监测：
•使用显微镜（如荧光显微镜或共聚焦显微镜）实时监测类器官或细胞的形态变化以及微生物的生长和侵染情况。
•可使用微型传感器监测培养环境中的pH、氧气浓度等变化。
4. 数据采集与分析
1.形态学观察：
通过显微镜定期拍摄类器官或细胞形态，观察微生物对宿主细胞的影响（例如细胞凋亡、屏障功能改变等）。
2.生物标志物检测：
可以通过取样（例如芯片中的流出液）进行进一步的生物学分析：
qPCR或RT-PCR：分析宿主细胞或微生物的基因表达变化。
ELISA：检测炎症因子或代谢产物。
流式细胞术：分析类器官或宿主细胞的存活率或凋亡情况。
3.代谢物分析：
取流出液样本，使用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等技术分析微生物代谢产物的浓度及其对宿主细胞的影响。
5. 终止实验与芯片清理
1.终止培养：
实验结束后，停止泵流，取出芯片中的残留培养基和微生物悬液，固定细胞和微生物用于后续分析（如免疫染色或扫描电镜观察）。
2.芯片清理与重复使用：
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注意事项
1. 无菌操作：类器官芯片对污染非常敏感，所有操作应严格在无菌环境中进行。
2. 芯片材料选择：根据实验需求选择不同材料的芯片，部分芯片对某些细胞或微生物可能有吸附或毒性效应，实验前应做验证。
3. 流体控制：流速过高或过低都可能影响共培养的效果。建议根据不同细胞和微生物的特性，进行预实验调整合适流速。
4. 平衡共培养条件：宿主细胞和微生物可能对培养条件有不同的要求，特别是培养基选择和营养供给方面，需要合理设计。
⚠️请注意，以上步骤需要根据实验室的具体条件和实验目的进行调整。在实际操作中，可能需要进行多次优化以达到最佳实验效果，仅供学习参考。
