文献精读：细胞间纳米管介导的线粒体转移增强了T细胞的代谢适应度和抗肿瘤疗效

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在肿瘤免疫治疗中，T细胞的功能和代谢活性是决定其疗效的关键因素。然而，实体肿瘤的微环境常常压制T细胞的代谢功能，导致其衰竭并失去抗肿瘤活性。近年来，研究人员发现线粒体在维持T细胞功能和代谢适应性中起着重要作用。然而，T细胞在肿瘤微环境中面临线粒体损伤和功能障碍的挑战，如何增强其线粒体活性成为一个亟待解决的问题。

在本研究中，德国雷根斯堡莱布尼茨免疫治疗研究所的Jeremy G. Baldwin教授（通讯作者）、Luca Gattinoni教授（通讯作者）和美国哈佛-麻省理工健康科学与技术联合学院Shiladitya Sengupta教授（通讯作者）团队提出了一种创新的线粒体转移平台，通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）与CD8⁺ T细胞之间的细胞间纳米管传递线粒体，显著提高了T细胞的线粒体质量和代谢功能。这种转移平台不仅增强了T细胞的抗肿瘤效力，还延长了其存活时间，并减少了T细胞的衰竭现象。此项研究为基于线粒体增强的细胞治疗提供了新的视角，展示了线粒体转移在免疫治疗中应用的巨大潜力。本研究不仅填补了关于细胞器移植领域的空白，还展示了如何利用纳米管促进T细胞线粒体功能的恢复，未来有望为实体瘤治疗开辟新途径。

（A-D）实验人员通过FESEM展示了人源（h-BMSC 和 h-T cell）和小鼠源（m-BMSC 和 m-T cell）细胞之间的纳米管连接结构。A图显示了细的纳米管，B图显示了粗的纳米管，B1图展示了具有分支的纳米管结构。C图和D图进一步展示了小鼠细胞中类似的纳米管连接，证实这种跨细胞的结构存在于不同物种之间。（E-G）实验人员量化了纳米管的数量、长度和宽度。E图显示每个细胞间大约形成一个纳米管，无论是人类还是小鼠。F图表明小鼠的纳米管长度较短，约为0-10 μm，而人类的纳米管长度变化较大，最长可超过40 μm。G图展示了纳米管宽度的差异，小鼠的纳米管较窄，而人类的纳米管宽度变化较大，有的宽度超过2 μm。（H、I）实验人员通过共聚焦显微镜进一步验证了线粒体通过纳米管进行跨细胞转运的过程。通过Mito-dsRed标记的线粒体在纳米管中清晰可见，绿色的Phalloidin标记了F-肌动蛋白，蓝色的DAPI标记了细胞核。在人类和小鼠的实验中，观察到了线粒体从BMSC转移至CD8⁺ T细胞的现象，表明这些纳米管不仅是物理连接，还在细胞间转运功能性物质（如线粒体）中发挥了重要作用。

（A）实验人员设计了一个示意图来展示线粒体从标记为Mito-dsRed（一种标记线粒体的红色荧光蛋白）的BMSC转移至CD8⁺ T细胞的共培养体系。该体系旨在促进线粒体的转移，从而增强CD8⁺ T细胞的代谢能力。（B）通过流式细胞术，实验人员显示了在经过48小时共培养后，Mito-dsRed⁺的CD8⁺ T细胞比例，说明有一部分CD8⁺ T细胞成功获取了来自BMSC的线粒体。（C）通过流式细胞术图展示了经过48小时共培养的CD8⁺ T细胞，经过dsRed信号的排序后，清晰显示了带有转移线粒体的CD8⁺ T细胞。（D）实验人员使用共聚焦显微镜图像展示了经过排序的CD8⁺ T细胞内部携带的来自BMSC的线粒体，标记为dsRed的线粒体在细胞内清晰可见，验证了线粒体的成功转移。（E）实验人员通过结合光学和电子显微镜的CLEM技术，进一步验证了线粒体的转移。图中显示dsRed信号与线粒体结构共定位的图像，证明转移的线粒体在CD8⁺ T细胞中保持结构完整。其中图E1、图E2一步展示了从BMSC转移到CD8⁺ T细胞中的线粒体的高分辨率电镜图像，显示了线粒体的内部结构（如嵴和双层膜）。（F）实验人员通过qPCR检测线粒体DNA含量，显示Mito⁺CD8⁺ T细胞中线粒体DNA的含量显著增加，表明转移的线粒体成功增加了CD8⁺ T细胞的线粒体质量。（G）通过限制性酶分析，实验人员证明了供体BMSC的线粒体DNA成功转移到受体CD8⁺T细胞中，验证了线粒体转移的有效性。（H）通过测量氧气消耗率（OCR），实验人员展示了Mito⁺和Mito^- CD8⁺ T细胞的代谢状态。数据表明，Mito⁺细胞显示出显著更高的基础呼吸和备用呼吸能力（SRC），说明线粒体转移增强了CD8⁺ T细胞的代谢功能。（I、J）图表进一步量化了Mito⁺CD8⁺ T细胞的基础呼吸能力，数据显示其代谢性能明显优于Mito^-细胞；同样的，备用呼吸能力（SRC）也在Mito⁺ CD8⁺ T细胞中得到了显著提升，表明这些细胞具备更强的能量生成能力以应对代谢压力。

（A）通过GSEA（基因集富集分析）显示，Mito⁺ CD8⁺ T细胞中有一组基因集显著富集，这些基因集与癌细胞从邻近细胞获取线粒体的基因上调有关。这表明线粒体转移存在共通的生物学特征。（B）热图展示了在人类和小鼠的Mito⁺ CD8⁺ T细胞中共同上调的26个基因，这些基因与细胞器运输及纳米管形成有关，进一步揭示了线粒体转移的机制。（C）火山图显示了Mito⁺和Mito^-人类CD8⁺ T细胞基因表达的差异，结果表明，与线粒体转移和膜延伸相关的基因（如Talin 2）在Mito⁺ T细胞中显著上调。（D）热图列出了在Mito⁺人类CD8⁺ T细胞中显著差异表达的22个基因，并展示了这些基因在小鼠CD8⁺ T细胞中的共同调控情况，进一步强调了Talin 2等基因在这一过程中的重要性。（E）过度表达分析（Overrepresentation Analysis）显示，Mito⁺ T细胞中与细胞骨架和焦点黏附相关的基因集显著富集，表明这些基因与线粒体转移过程中纳米管的形成密切相关。（F）实验人员通过添加L-788,123（一种抑制法尼基转移酶的药物），验证了纳米管在线粒体转移中的关键作用，结果显示BMSCs中的线粒体转移受到显著抑制。（G）实验人员通过MRE11染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析TLN2基因座的双链断裂修复，进一步揭示TLN2在纳米管形成及线粒体转移中的关键作用。（H）实验数据表明，TLN2在BMSC中被敲除后，BMSC向CD8⁺ T细胞转移线粒体的能力显著下降，验证了TLN2在该过程中不可或缺的作用。（I）实验人员通过qPCR分析，证明在与激活的CD8⁺ T细胞共培养后，BMSC中的TLN2表达水平显著上升，进一步说明TLN2在BMSC中启动纳米管形成并促进线粒体转移的关键作用。

（A、B）在皮下B16KVP黑色素瘤模型中，比较了Mito⁺和 Mito^-的pmel-1 CD8⁺ T细胞的抗肿瘤能力。A图显示，注射了Mito⁺ T细胞的小鼠肿瘤体积显著减少，表明Mito⁺ T细胞具有更强的肿瘤抑制效果。B图显示，接受Mito⁺ T细胞治疗的小鼠存活率显著提高，证明线粒体转移增强了T细胞的抗肿瘤效力，延长了小鼠的生存期。（C、D）流式细胞术分析了移植到小鼠脾脏中的Mito⁺和Mito^- pmel-1 CD8⁺ T细胞。C图展示了不同小鼠脾脏中Mito⁺和Mito^- T细胞的流式细胞图。D图量化了Mito⁺ T细胞在脾脏中的频率，结果表明Mito⁺ T细胞扩展更为显著。（E、F）在肿瘤组织中，E图显示了每毫克肿瘤组织中pmel-1 Ly5.1⁺ CD8⁺ T细胞的数量，结果表明Mito⁺ T细胞在肿瘤中浸润较多。F图通过共聚焦显微镜展示了Mito⁺T细胞有效浸润肿瘤，Mito^- T细胞则更多局限在肿瘤外围。（G、H）实验人员通过共聚焦显微镜进一步分析，G图显示了肿瘤浸润的Mito⁺T细胞内仍然保留了Mito-dsRed标记的线粒体，H图显示在非免疫细胞中未观察到dsRed标记的线粒体，表明线粒体转移的特异性。（I、J）实验人员通过Cell Trace Violet （CTV）跟踪细胞增殖，I图显示无论是Mito⁺还是Mito^- T细胞，都进行了广泛增殖。J图和K图显示，Mito⁺ T细胞的凋亡水平显著低于Mito^- T细胞，表明Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中具有更好的存活能力。

（A、J）使用UMAP（一种强大的维度约简技术，旨在提供可视化功能）绘制了Mito⁺和Mito^-的肿瘤浸润（A图）和脾脏（J图）pmel-1 CD8⁺ T细胞的分布情况。UMAP图展示了7天后，这些细胞在肿瘤和脾脏中表现出的不同分类群组。（B、K）密度图进一步显示了Mito⁺和Mito^-pmel-1 CD8⁺ T细胞在肿瘤（B图）和脾脏（K图）中分布的浓度差异。结果表明，Mito⁺细胞在肿瘤浸润的T细胞中更广泛分布。（C、L）通过T细胞亚型分类，实验人员利用ProjecTILs和Pauken增殖特征集对T细胞进行分类。结果显示，在肿瘤（C图）和脾脏（L图）中，Mito⁺和Mito^- T细胞分别呈现出不同的亚型分布，Mito⁺细胞表现出更具效应功能的特征。（D、G、M）小提琴图显示了T细胞在不同群组中的耗竭标志物（如PD-1和LAG3）的表达水平（D图和M图）以及细胞毒性分子（如GzmB）的表达（G图）。实验结果表明，Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中表现出较低的耗竭标志物水平，同时具有更强的细胞毒性分子表达。（E、F、H、I、N、O）通过流式细胞术分析，E图、H图和N图展示了Mito⁺和Mito^- pmel-1 CD8⁺ T细胞中PD-1与LAG3的表达情况，F图和O图则量化了不同处理组的PD-1和LAG3双阳性细胞的频率。结果表明，Mito⁺细胞具有显著更低的PD-1和LAG3表达水平，提示其抗耗竭能力较强。I图和O图进一步分析了PD-1和颗粒酶B（GzmB）的共表达情况，表明Mito⁺细胞在肿瘤微环境中表现出更强的细胞毒性和抗耗竭能力。

（A）使用SCENITH方法（一种简单的用于复杂代谢谱分析的方法）评估线粒体转移对CD8⁺ T细胞代谢能力的影响。图示展示了SCENITH分析的实验流程，细胞被分别用DMSO（绿色）、2-DG（橙色）、寡霉素（紫色）和哈林通素（灰色）处理，以抑制不同的代谢途径。通过嘌呤霉素掺入测量细胞的能量水平，以评估不同代谢路径对细胞的影响。（B）实验人员通过直方图展示了脾脏和肿瘤浸润性Mito⁺与Mito^- pmel-1 T细胞的嘌呤霉素掺入情况。结果表明，Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中表现出较高的嘌呤霉素掺入水平，说明线粒体转移增强了T细胞的代谢活性。（C-E）实验人员分别测量了脾脏和肿瘤中的Mito⁺和Mito- T细胞的总代谢能力（C图）、糖酵解能力（D图）和脂肪酸及氨基酸氧化能力（E图）。数据显示，Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中表现出更高的总代谢能力和糖酵解能力，但其脂肪酸和氨基酸氧化能力与Mito^-细胞相比变化不大。（F、G）实验人员通过UMAP图展示了Mito⁺和Mito^- T细胞的代谢特征。F图展示了脾脏中的细胞代谢特征，而G图展示了肿瘤浸润性T细胞的代谢特征，使用GSVA（基因集变异分析）进行代谢特征的颜色编码。结果显示，Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中具有更高的代谢活性。（H、I）小提琴图显示了Mito⁺和Mito^- T细胞的有氧糖酵解（H图）和氧化磷酸化（I图）途径得分。结果表明，Mito⁺ T细胞在肿瘤微环境中表现出显著更高的有氧糖酵解能力，而氧化磷酸化途径得分相对没有显著差异。

（A）通过细胞毒性实验评估了线粒体转移对CD19-CAR CD8⁺ T细胞杀伤NALM6-GL白血病细胞的能力。Mito⁺或Mito^- T细胞分别与未经处理或用溴化乙锭（EtBr）处理后的Mito-dsRed BMSCs共同培养。数据表明，具有正常线粒体功能的Mito⁺ T细胞表现出更高的细胞毒性，EtBr预处理使供体线粒体失去功能后，细胞毒性显著下降。（B）重复细胞毒性实验显示，经过多轮刺激后，Mito⁺ T细胞在对抗NALM6-GL白血病细胞时表现出更强的杀伤效应。数据表明，在每轮刺激后，Mito⁺ T细胞都保持了较高的细胞毒性水平。（C）代表性图像展示了经过六轮刺激后的效应T细胞与NALM6-GL白血病细胞共培养的情况。图中展示了未处理的NALM6-GL细胞和Mito⁺ T细胞的共培养图像，显示出明显的白血病细胞杀伤效果。（D）通过在移植有NALM6-GL白血病的小鼠体内检测，实验人员量化了转移Mito⁺或Mito^- CD19-CAR CD8⁺ T细胞后，每50 μL血液中循环NALM6-GL细胞的数量。实验结果表明，Mito⁺T细胞显著降低了循环白血病细胞的数量，表明其在体内具有更强的抗白血病能力。（E-F）E图展示了在体内生物发光成像中，注射Mito⁺ T细胞的小鼠体内的白血病细胞信号显著减弱，表明白血病细胞被有效抑制。F图展示了这些小鼠的生存率，Mito⁺ T细胞处理组的小鼠生存率显著高于其他组，进一步证实了线粒体转移增强了T细胞的抗肿瘤能力。（G）实验人员使用共聚焦显微镜展示了Mito-dsRed BMSCs与MART-1 TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）共培养的图像。共聚焦图像显示了Mito-dsRed标记的BMSC与TILs之间的相互作用，标记CD8⁺ T细胞的抗体用于显示共培养中的T细胞，进一步验证了线粒体在BMSCs和TILs之间的转移。（H）流式细胞术分析显示，经过48小时的共培养后，MART-1 TILs中有明显比例的T细胞成功获取了来自Mito-dsRed BMSCs的线粒体。流式细胞图表明，在活淋巴细胞中，Mito-dsRed阳性的T细胞占有显著比例。

综上所述，这项研究通过骨髓基质细胞（BMSCs）向CD8⁺ T细胞转移线粒体，显著提升了T细胞的代谢健康和抗肿瘤效力。研究发现，纳米管介导的线粒体转移能够增加T细胞的线粒体质量和代谢功能，从而提升其对恶劣肿瘤微环境的耐受性及抗肿瘤能力。在肿瘤模型中，线粒体增强的T细胞表现出更强的增殖能力和肿瘤浸润率，同时有效减少了衰竭迹象，显著延长了小鼠生存期。这一技术同样在体外系统性白血病和人类肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中表现出卓越的抗肿瘤活性，显示了其在个体化细胞疗法中的潜力。尽管目前线粒体转移的效率仍需进一步提升，但本研究为通过增强T细胞代谢状态来提高免疫治疗效果提供了新的方向和方法。

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