供稿：郝莹，武汉大学
校稿：史路菲，武汉大学
推送：史路菲，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Angewandte Chemie International Edition上，标题为Selective Photocatalytic C−H Oxidation of 5-Methylcytosine in DNA，通讯作者是来自剑桥大学化学系的Shankar Balasubramanian教授。
复杂生物大分子上的选择性C-H氧化是有机化学领域重点研究内容，5-甲基胞嘧啶（5mC）是DNA中一种非常重要的表观遗传修饰，对生物学具有重要意义，并已成为一种重要的生物标志物。5mC的选择性功能化将使新的化学方法能够标记、检测和绘制DNA甲基化，以加强对这种表观遗传特征的研究和利用。在本文中，作者介绍了一个使用光催化系统将DNA中的5mC直接和选择性化学氧化成5-甲酰胞嘧啶（5fC）的方法。该转化用于选择性标记5mC，对5mC和DNA中的遗传碱基腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）进行单碱基分离测序。
作者首先探索了碳氢氧化对核苷的选择性。通过原位生成的Fe-oxo物种选择性地通过HAT将碳氢键氧化为羰基。随后，作者以十钨酸盐为基础的多金属氧酸盐对5mdC的进行光化学转化，采用水溶性十钨酸钠（Na4W10O32）作为光催化剂，并研究了一系列单电子氧化剂作为目标5mdC氧化化学的终端氧化剂。使用5mdC、脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）和脱氧胸苷（dT）等摩尔混合物研究了反应动力学（图1a）。在120 min时，70%的5mdC转化为50%的5fdC收率。在图1a所示的数据中，基于以脱氧尿苷（dU）为外标的LCMS分析，dA、dC、dG和dT（CA、CC、CG和CT）的浓度在前120分钟内相对稳定，在所有的三次反应中保持在初始浓度的85%以上。化合物5-羟甲基脱氧胞苷（5hmdC）也可以在类似的反应条件下氧化为5fdC（图1b）。在3 h时，77%的5hdc被转化，5fdC的产率为60%。为了进一步了解Na4W10O32催化5mdC氧化为5fdC的选择性，在相同条件下直接处理5fdC。3 h后，在LCMS中观察到5fdC转化率为60%，5-羧基脱氧胞苷（5cadC）收率为20%（图1c）。这表明5mdC到5cadC的过度氧化可能在较长时间内发生。参考5cadC的形成，在5mdC光氧化后，用LC-MS也检测到微量的5cadC。
图1 Na4W10O32光催化氧化5mdC制5fdC
接下来，作者探索了DNA寡核苷酸中的5mC转化（图2），由于多阴离子磷酸二酯的DNA主链，这种转化需要水介质。本文提出了一种催化体系，该体系与25°C下90%的水溶液兼容，适用于DNA。在10 μM浓度下设计一个25mer脱氧寡核苷酸（5mC-25mer）与50 μM Na4W10O32反应20 min后，用质量定量法观察到寡核苷酸中5mC到5fC的转化率为27%。此外，将13mer脱氧寡核苷酸（5mC13mer ODN）在10 μM浓度下反应30分钟。利用DNA降解酶将寡核苷酸完全酶切为单核苷，然后进行LCMS分析，确认寡核苷酸中5fC的形成（图2b）；没有观察到5-羟甲基脱氧尿嘧啶（5hmdU）或5甲酰基脱氧尿嘧啶（5fdU），表明T的氧化未检测到双链DNA（dsDNA）。接下来作者进行了概念验证实验，以展示DNA中5mC的位点特异性标记以及5mC的碱基分辨率测序的示例。5mC残基转化为5fC后，DNA片段可以通过甲酰基的生物偶联反应进行标记和富集，例如使用含有氧胺或肼亲核试剂的生物素探针。将5mC-13mer ODN进行光催化氧化，将反应混合物直接与生物胺氨基己酸肼（10 mM）进行生物偶联反应（图2c）。在整个两步反应中，含有5mc的13mer与1个等效探针的共轭率约为30%（图2a）。使用标准寡聚物和非基于T的寡聚物的对照实验表明，在寡聚物水平上发生了明显的T氧化。
图2 将5mC残基转化为13mer ODN
为了证明十钨酸盐光催化氧化在碱基分辨率检测5mC方面的潜力，作者采用了下一代合成测序检测。当DNA中的5mC被氧化为5fC，就可以通过已知的反应进行5fC的化学选择性转化，使用1,3-茚二酮、丙二腈或吡啶-硼烷来改变修饰碱基的沃森-克里克氢键，从而在PCR扩增过程中导致5mC到T的整体转化（图3a）。设计了两步测序前化学转化DNA，包括5mC残基的初始光化学氧化到5fC，然后是5fC的丙二腈转化。随后，在文库制备和下一代DNA测序之前，对所得DNA进行PCR扩增以产生5mC-T碱基变化（图3a）。作者在5mC-13mer上测试了两步化学反应（图2d），13mer被氧化，然后在22°C的400 mM丙二腈水溶液中搅拌20小时。纯化后的ODN在LCMS分析中观察到相应的丙二腈加合物的质量，证实了整体转化。为了证明该方法在5mC测序中的应用，制备了一个带有5mC-100mer残基（5mC-100mer）的100mer单链DNA （ss-DNA），并进行了光催化氧化化学处理，然后进行了丙二腈反应。所得到的DNA混合物通过PCR扩增，然后转化为DNA文库进行测序。平行制备阴性对照，不使用光催化剂，用5fC代替5mC （5fC-100mer）的100mer ss-DNA作为阳性对照。对扩增的样品进行测序。测序数据显示，在所有可用的测序reads中，5mC位点的5mC-t转化率为32%（图3b）。阴性对照的5mC-T转化率低于0.5%，阳性对照的5mC-T转化率为81%，反映了丙二腈转化步骤的效率。非特异性错误率（其他碱基的意外突变）低于0.5%，表明该方法对5mC具有特异性。
图3 测序一个5mC残基在一个100mer的ss-DNA
在本文中，作者介绍了一种新的基于化学的方法，通过光催化系统驱动HAT选择性地将DNA中的5mC氧化为5fC。该光催化系统在温和的水环境下氧化复杂生物大分子中的碳氢键，具有化学选择性和位点选择性。这项研究举例说明了现代催化如何有潜力改变生物分子的分析，这种转化的进一步发展和优化将使未来在生物学研究中的应用成为可能。
文章编号：454
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202413593
原文引用：
Tao Yan, Yuqi Chen#, Ben Mortishire-Smith#, Angela Simeone#, Alexandre Hofer, and Shankar Balasubramanian*. Selective Photocatalytic C−H Oxidation of 5-Methylcytosine in DNA. Angew. Chem. Int. Ed., 2024, e202413593.（#为共同第一作者）
