供稿：张杉，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Journal of the American Chemical Society上，标题为DNA 5-Methylcytosine-Specific Amplification and Sequencing，通讯作者是芝加哥大学的何川教授。
DNA甲基化 （5mC）作为哺乳动物复制后的主要表观遗传标记，在各种生物学途径中起着至关重要的作用，包括基因表达、发育调控和肿瘤的发生。对DNA甲基化功能的深入了解主要依赖于亚硫酸氢盐测序（BS-seq），可以实现对5mC的单碱基分辨率的定位及定量。然而剧烈且苛刻的化学反应条件会降解绝大多数底物DNA，使得该方法对微量样本的检测存在极大的挑战性。因此，开发无亚硫酸氢盐或者在DNA扩增过程中可以准确地扩增5mC模式的方法是十分必要的。此外，传统的方法无法区分5mC和5hmC，这限制了DNA甲基化的动力学研究。
DNA甲基化由三种典型的DNA甲基转移酶维持，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。虽然DNMT3A和DNMT3B负责从头甲基化，但DNMT1在DNA复制过程中将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的甲基转移至甲基化CpG位点的胞嘧啶上。受DNA复制过程中保守的甲基化调控的启发，本文开发了一种从有限的样本开始特异性保留5mC的全基因组扩增方法，通过将有限的DNA样本扩增到准确地扩增原始5mC，此外，该方法不会收到5hmC的干扰，可以实现后续的亚硫酸氢盐测序中准确定位5mC。因此，作者将其命名为5mC保留全基因组扩增（5mC WGA）。
本文设计原理是始于将原始链置换扩增与DNMT1半甲基化活性结合起来。首先，作者用已经有明确的CpG甲基化信息人脑基因组DNA进行测试，。通过DNA聚合酶phi29和DNMT1的优化组合，成功地将输入DNA扩增了至少100倍，范围从10ng到10pg，准确地保留了5mC。随后，扩增产物经过亚硫酸氢盐处理、用预先设计的引物进行PCR扩增和Sanger测序。结果表明，5mC WGA以高精度扩增了高甲基化位点，但在非甲基化区域内没有产生甲基化（图1a）。扩增产物进一步进行MeDIP-seq（甲基化DNA免疫沉淀和测序）以及批量对照。结果再次证明了扩增过程中DNA甲基化的准确保留（图1b）。随后，在进行高通量测序验证之后，作者继续在反应体系中加入了无启动偏倚的DNA引物酶TthPrimPol，通过优化扩增系统和最佳甲基化条件，获得了类似的5mC保留扩增。
图1 5mC WGA 方法验证
随后，作者继续测试了三种酶的全基因组扩增系统，扩增了从mES细胞中纯化的10 pg基因组DNA，并对产物进行亚硫酸氢盐处理，构建文库。作者将测序结果与两个对照样品一起分析：一个是未经任何处理的10 pg gDNA，另一个是在相同条件下未经DNMT1扩增的。当与大量阳性对照进行比对时，扩增样本都显示出甲基化保留，与直接亚硫酸氢盐处理的对照相比，甲基化水平略低，而所有CHG和CHH水平都保持较低水平（图2a）。在没有DNMT1的阴性对照展现相当低的甲基化水平，这证实了DNMT1在扩增过程中负责甲基化的维持。GC含量偏差分析没有显示出对某些GC含量的任何显著偏差，这表明含有5mC的区域普遍扩增。与标准商业文库构建试剂盒相比，本文的方法在扩增过程中没有引入偏倚。基于CpG甲基化水平的分层聚类显示，作者从低输入生成的扩增文库具有很高的可重复性（图2b）。三个不同样品之间的高度相关性也验证了高再现性（图2c）。覆盖良好的甲基化基因分布图显示了一种典型的甲基化模式，其中TSS区域显示低甲基化，而基因body区域富集DNA甲基化（图2d）。
图2 5mC WGA方法的开发
随后作者分析比较了来自5mC WGA-BS、oxBS-seq和TAB-seq的所有非甲基化、甲基化和羟甲基化C位点。虽然本文的方法显示出与oxBS-seq类似的模式，但TAB-seq显示出了与预期不同的趋势（图3a）。在5mC点样中，5mC WGA BS与oxBS-seq显示出高度相关性（图3b）。5hmC倾向于以低于5mC的丰度存在，并标记了更多动态的5mC位点。此外，由于已知基因体上5hmC的富集，与常规亚硫酸氢盐测序相比，使用5mC-WGA-BS检测到的5mC甲基化水平有所降低（图3c）。这些结果证实5mC WGA BS准确地揭示了5mC位点，并可以帮助获取5hmC信息（图3d）。所有这些分析表明，本文的方法是一种可靠的5mCpG特异性检测方法，适用于有限的输入材料。
图3 几种甲基化测序方法的比较
文章编号：420
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b12707
原文引用：
Chang Liu#, Xiaolong Cui#, Boxuan Simen Zhao#, Pradnya Narkhede, Yawei Gao, Jun Liu, Xiaoyang Dou, Qing Dai, Li-Sheng Zhang, Chuan He*. DNA 5-Methylcytosine-Specific Amplification and Sequencing. J Am Chem Soc., 2020;142(10):4539-4543. (#为共同第一作者)
