供稿：季彤彤，武汉大学
校稿：赵晨茜，武汉大学
推送：赵晨茜，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nucleic acids research上，标题为The human AP-endonuclease 1 (APE1) is a DNA G-quadruplex structure binding protein and regulates KRAS expression in pancreatic ductal adenocarcinoma cells，通讯作者是内布拉斯加大学的Kishor K. Bhakat教授。
胰腺导管腺癌（PDAC）是美国癌症相关死亡的第三大原因，其对化疗和放疗具有高度耐药性。因此，PDAC的有效治疗仍是一个主要的临床挑战。原癌基因KRAS是PDAC中最常见的突变癌基因（约95%的病例）。所以，抑制突变KRAS会影响胰腺癌细胞的生存能力。因此，KRAS突变体表达在PDAC中的重要性促使多项研究在转录和翻译水平上针对其进行研究。G-四链体（G4）是一种特殊的DNA结构，存在于许多致癌基因启动子区域，与癌基因的表达调节、染色质状态的改变以及基因组稳定性有关，已经成为了癌症治疗的重要靶点。
研究表明，G4 DNA结构是转录因子（TF）结合的枢纽。近端G4位于转录起始位点（TSS）上游-148和-116 bp之间，与核酸酶超敏元件重叠，MAZ、hnRNP A1和PARP-1等TF在该区域的结合可激活KRAS表达。尽管G4在KRAS转录调控中的作用已经得到了明确，但对于细胞中调节这些G4结构的形成和稳定性的分子机制知之甚少。
人源脱嘌呤/脱嘧啶（AP）核酸内切酶APE1可通过保守的碱基切除修复（BER）途径，在内源性氧化和烷基化DNA损伤的修复中发挥核心作用。最近研究证明了细胞中APE1和G4结构在全基因组范围内的相关性，本文在此基础上证明APE1是一种G4结合蛋白，在基因组中稳定G4结构的形成中起关键作用，并调节PDAC细胞中KRAS的表达。
作者首先使用G4结构特异性抗体克隆1H6检测了PDAC细胞系MIA PaCa-2和PANC-1中G4结构的形成。使用该抗体和SIM，可以主要在MIA PaCa-2细胞的细胞核中检测到G4，在这些细胞中观察到G4和APE1染色之间的共定位（图1A）。G4稳定配体PDS增加了G4数量以及G4病灶与APE1染色之间的共定位（图1A-C）。通过在Dox诱导的启动子下稳定表达APE1shRNA来下调APE1，导致MIA PaCa-2和PANC-1细胞系中可检测到的G4数量显著减少(图1D)。此外，PDS处理对APE1下调细胞的G4染色没有影响。相反，在稳定表达NTCshRNA的细胞中，Dox处理对G4染色没有影响（图1E-F）。作者还检测了APE1 KD对表达WT KRAS的BxPC-3细胞系G4染色的影响。在表达对照空载体的BxPC3细胞中观察到相当数量的G4和APE1染色。KD APE1在BxPC-3细胞中稳定表达APE1shRNA，G4染色消失（图G-H）。此外，APE1的下调明显降低了G4的染色，回补实验能恢复G4的颜色。以上结果表明，APE1在PDAC细胞中与G4共定位，并在基因组中G4结构的形成中起关键作用。
图1. APE1在细胞中G4结构的形成中起着至关重要的作用
作者合成了一个与KRAS G4近端基序对应的6- FAM标记的32-mer寡核苷酸 (图2A)，并通过在50 mM KCl存在下孵育该寡核苷酸诱导G4折叠。通过圆二色谱（CD）光谱分析证实了平行G4结构的形成 (图2B)。FP分析，WT APE1蛋白对KRAS G4结构具有很强的亲和力。相比之下，WT APE1对不能形成G4结构的寡核苷酸没有表现出可测量的结合亲和力（图2C-D）。与未标记的形成G4的KRAS寡核苷酸竞争分析显示，EC50值为2.3±1.5 M，进一步强调了APE1与KRAS G4结构之间的高亲和力结合（图2E）。随后作者通过测量在WT APE1蛋白溶液中加入越来越多剂量的形成KRAS G4后色氨酸荧光的猝灭来确定WT APE1与KRAS G4结构的结合（图2F）。Scatchard图显示，WT APE1蛋白与 KRAS G4 结构的特异性（红色）和非特异性（黑色）结合的解离常数（Kd）为12 nM，表明APE1与G4的结合亲和力非常强（图2G）。此外，将重组WT APE1加入到G4形成的KRAS寡核苷酸中，导致265 nm左右的正椭圆率增加，这表明WT APE1具有结合并促进G4结构折叠的能力，而非G4的DNA却没有影响，表明APE1带正电的N端可能促进G4的折叠，从而促进G4在体外的折叠（图2H）。FP分析和色氨酸荧光猝灭研究的数据表明，WT APE1蛋白与KRAS启动子G4结构具有很强的结合亲和力，其解离常数在纳摩尔范围内。
图2. APE1结合KRAS启动子G4结构具有很强的亲和力
随后，作者利用APE1和G4特异性抗体和启动子定向定量PCR (ChIP- qPCR)检测了APE1和G4在KRAS近端启动子区域的共定位。结果表明，在KRAS启动子G4区域，APE1和G4结构显著富集，而不是对照的非G4序列包含区域，对APE1进行KD之后KRAS启动子上的G4富集显著减少（图3A-B）。检测了APE1 KD对KRAS表达的影响。通过qRT-PCR分析，发现在MIA PaCa-2、PANC-1和BxPC-3细胞系中，通过稳定表达ap1shrna下调APE1可显著降低KRAS的表达（图3C）。在PDS或TMPyP4治疗后，可以观察到MIA PaCa-2细胞中KRAS表达显著增加。相反，在APE1 KD细胞中，同样的处理未能显著增加KRAS的表达，再次强调了APE1通过调节稳定G4结构的形成来调节KRAS表达的关键作用。PDS处理PANC-1细胞系后，KRAS表达也发生了类似的变化（图3C-D）。综上所述，这些数据表明APE1在KRAS启动子的G4结构形成中起着至关重要的作用，从而调节KRAS的表达。
图3. APE1与细胞中KRAS启动子G4区相关，调控KRAS的表达
免疫荧光实验结果显示，APE1 KD MIA PaCa-2细胞中G4染色的丧失可以通过在这些细胞中重新引入APE1氧化还原突变体C65S/C99S来恢复，这表明APE1的氧化还原功能不参与G4结构形成的调控（图4A-B）。C65S/C99S APE1进行的G4:APE1 PLA实验显示了相当数量的PLA点，表明APE1氧化还原突变体具有与细胞中G4结构相互作用的能力（图4C-D）。为了进一步证实APE1的氧化还原功能不参与G4调控，作者使用APE1氧化还原抑制剂E3330，对G4和APE1进行免疫荧光实验。增加E3330剂量处理细胞后，G4染色没有变化，从而证实APE1的氧化还原功能不参与细胞中G4形成的调节（图4E）。作者还使用qRT-PCR检测了氧化还原突变体C65S/C99S APE1对KRAS表达的影响。分析显示，与对照细胞相比，转染C65S/C99S APE1的细胞中KRAS的表达没有明显变化，这表明氧化还原功能不参与调节KRAS的表达（图4F）。
图4. APE1的氧化还原功能不参与G4结构形成和G4介导的KRAS表达的调控
体外集落形成实验显示，与对照组MIA PaCa-2细胞相比，MIA PaCa2细胞中的APE1 KD显著减少了集落数量（图5A）。APE1的KD导致MIA PaCa-2细胞对奥沙利铂、吉西他滨（图5C）和药物5-FU的敏感性显著增加（图5B-C）。为了验证APE1的KD是否也能增强对5-FU和奥沙利铂的敏感性，并在体内抑制PDAC肿瘤的生长，作者利用MIA PaCa-2APE1shRNA细胞的肿瘤异种移植模型。从肿瘤体积来看，两种药物单独治疗对对照（不含Dox）小鼠的肿瘤生长均有中等影响，但同样的治疗显著降低了饲喂Dox小鼠MIA PaCa-2APE1shRNA细胞的肿瘤生长，表明APE1的KD在体内使PDAC细胞生长增敏（图5D-E）。总的来说，本文的数据表明，APE1的KD增加了PDAC细胞对体外和体内常规化疗药物敏感性。
图5. APE1 KD在体外使PDAC细胞对化疗增敏，在体内抑制异种移
植物肿瘤的生长
最后，作者使用APE1和G4结构特异性抗体进行免疫组化分析，确定了23例PDAC患者组织样本和2例正常对照胰腺组织中APE1和G4 DNA的水平。基于阳性染色细胞百分比和染色强度的IHC评分显示，与正常对照相比，PDAC肿瘤组织中APE1和G4 DNA水平显著升高（图6A）。进一步分析显示，APE1和G4染色在这些组织样本中呈强正相关，特别是在IV期肿瘤中（图6B）。这表明在高侵袭性PDAC肿瘤中，APE1水平升高与G4 DNA水平升高有关。为了确定PDAC中G4和APE1水平升高的临床意义，作者将APE1和G4 DNA水平与化疗（包括吉西他滨、卡培他滨、亚叶酸钙调节的5-FU、奥沙利铂等）患者的生存率联系起来。生存率分析显示，在23例PDAC患者中，与其他染色评分较低的患者相比，7例APE1和G4 IHC染色评分最高的患者存活时间较短（图6C）。这些数据为APE1和G4 DNA的表达水平与PDAC患者的预后呈负相关提供了初步证据。
图6. PDAC患者组织样本中APE1和G4 DNA水平升高
综上所述，本文发现APE1不仅是一种多功能DNA修复酶，而且是一种G4结合蛋白。APE1的缺失会破坏细胞中稳定的G4结构的形成，揭示了APE1在调节PDAC中稳定的G4形成和KRAS表达中的关键作用，并突出了G4结构作为PDAC的基因组特征，具有潜在的临床应用前景，可作为新的预后标志物和治疗靶点。
文章编号：411
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136122
原文引用：
Suravi Pramanik, Yingling Chen, Heyu Song, Irine Khutsishvili, Luis A. Marky, Sutapa Ray, Amarnath Natarajan, Pankaj K. Singh and Kishor K. Bhakat*. The human AP-endonuclease 1 (APE1) is a DNA G-quadruplex structure binding protein and regulates KRAS expression in pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Nucleic Acids Res. 2022; 50(6):3394-3412.
