供稿：刘玮，武汉大学
校稿：余思宇，武汉大学
推送：余思宇，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nucleic Acids Research上，标题为The impact of the embryonic DNA methylation program on CTCF-mediated genome regulation，通讯作者是巴黎西岱大学的Maxim V. C. Greenberg教授。
在哺乳动物胚胎发生过程中，5-胞嘧啶DNA甲基化（5meC）图谱和三维（3D）染色质结构都在“表观遗传重编程”的过程中被深刻重塑。在哺乳动物受精后发育的早期阶段，大部分配子5meC被清除；随后，在着床过程中，新生DNA甲基转移酶3A和3B （DNMT3A和DNMT3B）迅速建立了胚胎DNA甲基化图谱。这一时期被称为原始态-始发态（naïve-to-primed）多能性转变，发生在胚层形成之前。在哺乳动物细胞核中，染色质以层次结构组织，范围从多碱基染色体区域到更局部的顺式调控接触。有几种结构蛋白参与染色质组织，CCCTC结合因子（CTCF）是最具特征的一种。CTCF是一种锌指ZF蛋白，在哺乳动物中高度保守，可与基因组中数万个位点结合。而表观遗传重编程中5meC通量本身如何影响3D基因组仍未得到充分研究。在本研究中，作者使用小鼠胚胎干细胞（ESC）分化方案来模拟胚胎5meC动力学，分析了CTCF结合图谱，以探究胚胎DNA甲基化程序如何在动态系统中影响3D染色质结构。
1 DNA甲基化影响CTCF在少数位点的结合
在无血清培养基中培养的naïve ESCs，特征是低水平的DNA甲基化，会分化为上皮细胞样细胞（EpiLCs），诱导向引物多能性过渡。同时，作者使用了Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b三敲除（TKO）细胞系。在naïve ESCs中，表现出极低的5meC水平：所有CpGs中<10%被甲基化（图1A，B）。作者在EpiLCs的野生型（WT）和突变体第4天（D4）中进行了CTCF CUT&RUN（一种用于研究染色质中蛋白质与DNA相互作用的高通量技术）。相比于TKO EpiLCs与naïve ESCs的相似性，WT和TKO EpiLCs的CTCF结合格局在整体上更为相似（图1C）。这说明细胞类型在决定CTCF占用率方面比DNA甲基化本身起着更重要的作用。大量的CTCF峰在TKO EpiLCs中特异性富集：66905个总峰中有748个（图1D，E）。通过分析全基因组亚硫酸盐（WGBS）数据，作者发现绝大多数TKO rich位点在WT中获得DNA甲基化（图1F）。此外，作者还检查了TKO特异性位点上CTCF结合基序内CpGs的DNA甲基化状态。CTCF核心结合基序可能包含许多CpG位点，这些位点已被证明在甲基化时影响CTCF-DNA的相互作用，其中JASPAR基序的第5位（CpG5）（图1G）在生化研究中表现出最显著的作用。这表明，局部染色质环境中的DNA甲基化，可能通过与甲基化敏感的DNA结合蛋白的相互作用，在形成CTCF结合图谱中发挥重要作用。随后，作者重点研究了含有CpGs的CTCF结合位点。与整体DNA甲基化模式一致（图1F），CTCF识别位点内的两个CpG二核苷酸（CpG5和CpG15）显示DNA甲基化富集（图1G）。
图1 CTCF在少数位点表现出潜在的5meC敏感性
2 三维基因组结构在DNA甲基化缺陷多能细胞中被整体保存
作者在WT和TKO ESCs和EpiLCs中对CTCF进行了Hi-ChIP（一种用于解析染色质构象的技术），Hi-ChIP数据集按细胞类型而不是基因型分组（图2A）。通过按细胞类型合并数据，ESCs中的总CTCF峰为117294个，而EpiLCs中的CTCF峰为121430个，增加了3.5%。接下来，作者对Hi-ChIP数据中那些将CTCF结合位点连接在一起的接触点进行了差异分析，发现876个ESCs特异性环路和1523个EpiLCs特异性环路（图2B）。这可能意味着细胞类型特异性基因调控程序得到巩固。
作者通过富集组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）标记的区域来评估增强子-启动子接触。与CTCF和转录组数据一致，H3K27ac图谱的细胞类型聚类比基因型更强（图2C），共识别出3802个ESCs特异性H3K27ac触点，以及1864个EpiLCs触点（图2D）。在ESCs和EpiLCs的标记基因中，它们不依赖于DNA甲基化状态，而H3K27ac富集的增强子-启动子接触发生了巨大的变化（图2E）。TKO EpiLCs中染色质结构的整体保存说明DNA甲基化对于产生naïve多能性是必不可少的。
图2 在WT和TKO背景下，染色质结构在EpiLCs分化过程中被重塑
3 TKO EpiLCs特异性CTCF环与离散位点的基因失调相关
作者使用更严格的阈值参数进行分析，在DNA甲基化突变体中发现了43个差异环，而只有两个环在WT型EpiLCs中富集（图3A）。CTCF介导的染色体折叠可以确保增强子与启动子接触，从而实现适当的基因表达，同时将启动子与异常的增强子相互作用隔离（图3B）。作者探究了从头DNA甲基化程序是否可以对CTCF依赖性基因控制产生影响，首先定义了所有的交互：CTCF-CTCF，CTCF-Other，H3K27ac-H3K27ac和H3K27ac-Other。作者发现大多数相互作用分别是CTCF-CTCF和H3K27ac-H3K27ac。从剩下的位点中，筛选出了四个值得进一步分析的候选位点：Csf1、Mob3b、Nrp2和Zdbf2。Csf1编码一种巨噬细胞刺激因子，该因子在小鼠组织中广泛表达，对维持组织特异性巨噬细胞群很重要；Mob3b是高度保守的单极纺锤体结合物基因家族的一部分，虽然蛋白质产物没有已知的酶功能，但它们被认为是支架蛋白，并且与许多人类疾病有关；Nrp2编码一种跨膜蛋白，该蛋白参与细胞骨架、血管生成和癌症进展的一系列信号通路；Zdbf2编码一种含有DBF4型锌指结构域的蛋白质，该基因在淋巴细胞中有印记和父本表达，但在胎盘中更随机地表达。在印迹的Zdbf2位点上发现了TKO EpiLCs中富集的最显著的差异CTCF环，差异环的存在与Zdbf2表达的降低相关（图3C）。
Zdbf2位点上的差异环锚定在位于Zdbf2启动子和上述四个增强子之间的CTCF结合位点上。在WT EpiLCs中，CTCF结合缺失，这与其结合位点5位5meC的增加相关（图3D）。在维持CTCF结合的TKO EpiLCs中，H3K27ac Hi-ChIP数据显示，与WT相比，TKO EpiLCs中Zdbf2启动子与上游增强子之间的相互作用较少（图3D）。这说明，与低甲基化naïve ESCs状态相比，Zdbf2启动子在分化的后期时间点上表达更高，表明与上游增强子的相互作用显著增加。
图3 在缺乏5meC的EpilCs中，CTCF环和启动子-增强子接触的一个子集被破坏
4 表观基因组编辑证实了DNA甲基化-CTCF拮抗作用
为了证明DNA甲基化本身会影响CTCF结合和下游调控缺陷，而不是间接的CTCF介导的作用，作者使用CRISPR/Cas9 SunTag/TET1系统进行了位点特异性DNA去甲基化。作者推测，持续的DNA去甲基化会导致CTCF结合增加，但是根据调控模式的不同，基因要么增加表达（如Csf1、Mob3b和Nrp2），要么抑制（如Zdbf2）（图4A）。结果显示，与对照相比，每个候选位点都有强大的靶向DNA去甲基化（图4B）。接下来，作者评估了CTCF结合增加时，局部基因表达是否会改变。在Csf1、Mob3b和Nrp2中，未观察到与模型一致的表达变化。在表观基因组编辑的Zdbf2位点上富集CTCF导致Zdbf2表达显著降低（图4C，D），与模型相吻合。
图4 胞嘧啶去甲基化导致Zdbf2位点CTCF结合增加
综上所述，本研究利用ESC到EpiLC的分化系统，在发育中的胚胎中使用表观基因组编辑来修饰染色质结构，揭示了DNA甲基化敏感的CTCF结合事件。本研究提供了一个全面的观点：胚胎DNA甲基化程序会影响染色质折叠，从而作为一种控制基因表达的手段。
文章编号：428
原文链接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkae724
原文引用：
Ana Monteagudo-Sánchez#, Julien Richard Albert#, Margherita Scarpa, Daan Noordermeer, Maxim V.C. Greenberg*. The impact of the embryonic DNA methylation program on CTCF-mediated genome regulation. Nucleic Acids Res., 2024, 10.1093/nar/gkae724. （#为共同第一作者）
