供稿：余思宇，武汉大学
校稿：冯甜，武汉大学
推送：冯甜，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Advanced Science上，标题为Sleep Deprivation Triggers the Excessive Activation of Ovarian Primordial Follicles via β2 Adrenergic Receptor Signaling，上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院赖冬梅教授为本文通讯作者。
睡眠在健康中起着至关重要的作用，不仅影响认知功能、情绪、心理健康、心脑血管和代谢健康，还影响女性的卵巢功能。在较长一段时间内保持大多数原始卵泡处于休眠状态对于保护初始卵泡储备至关重要。休眠的原始卵泡激活加剧和卵泡闭锁加速是卵巢储备过早消耗的主要原因，导致卵巢早衰。激酶插入域受体（KIT）配体（KITL），又称干细胞因子（SCF），和受体酪氨酸激酶（RTK）结合后，磷酸肌苷3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）和Janus激酶/转录激活因子（JAK/STAT）通路被激活。这种参与信号通路有助于调节细胞增殖、分化、存活和迁移。原始卵泡颗粒细胞（pfGCs）通过KITL与卵母细胞KIT相互作用，激活PI3K信号级联，触发卵母细胞觉醒。然而，潜在的机制仍不清楚。
研究概述图
为了确定睡眠剥夺（SD）对卵巢功能的影响，作者团队对小鼠分别给予了0、3和6天的SD处理。SD处理后小鼠体重明显下降（图1B）。随后，对小鼠卵巢进行称重，SD处理6天后，卵巢重量明显减轻（图1C）。SD治疗6天后，小鼠血清抗苗勒管激素（AMH）水平显著升高（图1D）。然而，SD处理后小鼠血清雌二醇（E2）和促卵泡激素（FSH）水平没有明显差异（图1E，F）。作者团队对小鼠卵巢卵泡进行组织病理学检测，通过苏木精和伊红（HE）染色，检查小鼠卵巢卵泡，结果显示原始卵泡和总卵泡数量均大幅减少，窦卵泡数量大幅增加（图1G），提示卵巢对SD高度敏感，导致原始卵泡的丧失。
图1 SD诱导原始卵泡的丧失
作者团队基于基因聚类分析和先前的研究确定了各种细胞类型（图2B）。这些细胞类型的KEGG通路富集分析表明，SD可以影响卵巢和卵泡发育的相关通路（图2C）。颗粒细胞簇的统一流形近似和投影（UMAP）图显示了三个亚群：颗粒0、颗粒1和颗粒2（图2D）。随后分析表明，睡眠剥夺影响颗粒细胞的多种生物学过程，包括生殖结构发育、生殖系统发育、性腺发育、男性性别分化以及女性妊娠过程中涉及的母体过程（图2F）。此外，蛋白质折叠、细胞运输、核糖体生物发生和组织发育等过程也受到影响（图2G）。
KIT在三个颗粒亚群中的表达分析显示，颗粒细胞0和2的表达水平显著上调（图2H）。卵巢组织蛋白免疫印记分析进一步证实，SD后小鼠体内KIT和KITL的表达水平明显升高（图2I，K）。卵巢免疫荧光染色显示KIT蛋白定位于原始卵泡（图2J）。作者团队对小鼠卵巢进行了离体培养后观察到，KITL处理的组织中有明显的卵泡激活和卵泡发育比例增加（图2L）。此外，KIT在KITL处理的卵母细胞中表达升高（图2M）。
图2 SD后小鼠卵巢细胞单细胞转录组分析及KIT在激活卵巢原始卵泡中的作用
蛋白免疫印迹实验显示卵巢组织中AMH和透明带精子结合蛋白3（ZP3）蛋白明显上调（图3A，E，F）。PI3K和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路激活休眠的原始卵泡，促进卵泡的进一步发育和生长原始卵泡。蛋白免疫印记进一步证实了SD后参与卵泡活化的关键通路PI3K和mTOR的磷酸化水平（图3C，H-J）。卵巢的免疫荧光染色显示这些蛋白在原始卵泡中的定位（图3D）。这些结果进一步表明，在SD小鼠卵巢中，原始卵泡可能过度激活。
图3 免疫印迹法检测SD后小鼠卵巢中AMH和ZP3蛋白表达增加
SD可增强健康成人的肾上腺反应性。在小鼠中进行肾上腺切除术（ADX）以研究腺体对其的作用（图4A）。在进行肾上腺切除术并伴有或未伴有SD的小鼠之间，卵巢重量、体重、原始卵泡计数或总卵泡数均无显著差异（图4B-D）。因此，肾上腺的变化可能是SD后小鼠卵巢重量、原始卵泡计数和总卵泡数显著减少的关键因素。
图4 SD诱导的原始卵泡丢失依赖于肾上腺
去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E）都会导致原始卵泡的丢失。SD暴露3、6天后，小鼠肾上腺重量明显增加（图5A）。然后作者团队分析了小鼠血清中的应激激素水平，观察到SD后NE（图5B）和E（图5C）显著增加。在给予小鼠E干预后，作者团队观察到卵巢重量明显减少（图5F）。经NE治疗后卵巢重量虽无显著差异，但呈下降趋势（图5F）。NE和E均导致小鼠卵巢原始卵泡减少，而窦卵泡数量增加（图5G）。结果表明，肾上腺素能激素E和NE可直接降低小鼠卵巢原始卵泡的数量。
图5 去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E）均可诱导原始卵泡的丧失
接下来，作者团队使用ADRB2受体激动剂（CLEN和SAL）处理的小鼠模型研究了ADRB2激活是否影响原始卵泡。小鼠给予含CLEN水6天后，卵巢重量（图6A）和原始卵泡数量明显减少（图6B），而窦卵泡数量明显增加（图6B）。同样，腹腔注射SAL 6天后，卵巢重量（图6C）和原始卵泡数量（图6D）均明显减少，卵泡总数也有下降趋势。作者团队向睡眠剥夺小鼠腹腔注射ADRB2拮抗剂ICI-118551 （ICI），ICI处理后的SD小鼠卵巢重量明显增加（图6E）。这些结果表明，注射ICI能有效地挽救SD诱导的小鼠原始卵泡损伤。
图6 ADRB2信号通路的激活可诱导原始卵泡的丢失
用CLEN或SAL的ADRB2激动剂处理小鼠卵巢后，作者团队观察到小鼠卵巢组织中KIT和KITL的蛋白表达水平显著升高（图7A，B）。用ADRB2激动剂CLEN和SAL体外处理卵巢颗粒细胞（KGN），结果显示mRNA和AKITL蛋白表达水平显著升高（图7C-E）。
在CLEN和SAL处理后，KGN细胞中的cAMP浓度增加（图7F），同时pPKA水平显著增加（图7G，H）。通过对SAL刺激KGN后KITL与pPKA蛋白表达水平的相关分析，发现两者呈强正相关（图7I），提示PKA的激活可能是KITL表达上调的关键因素。随后，用cAMP处理KGN细胞显著增加KITL蛋白的表达（图7J）。用PKA激活剂bucladesine钠（BC）处理KGN后，KITL水平显著上调（图7K）。相反，PKA拮抗剂staurosporine（STA）和H-89二盐酸（H89）刺激KGN可导致KITL水平下调（图7L，M）。综上所述，这些结果表明ADRB2轴通过激活SD诱导的原始卵泡中的cAMP/PKA通路来调节KITL的表达。
图7 激活的ADRB2通过cAMP/PKA途径上调KITL
作者团队的研究揭示了SD导致肾上腺过度活跃，导致β2肾上腺素分泌增加的机制，这又导致ADRB2受体的过度激活，随后通过cAMP/PKA途径触发KIT/KITL的过度表达，从而使原始卵泡的过度激活，最终使得卵巢储备功能的丧失。
文章编号：442
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202402393
原文引用：
Lichun Weng, Hanqing Hong, Qinyu Zhang, Chengqi Xiao, Qiuwan Zhang, Qian Wang, Ju Huang, Dongmei Lai*, Sleep Deprivation Triggers the Excessive Activation of Ovarian Primordial Follicles via β2 Adrenergic Receptor Signaling, Adv. Sci., 2024, 2402393.
